Jichha pacha†Jichha pacha: OX11 0DE, Reino Unido, Diamond Building, Harwell Ciencia y Innovación Park, Dietcote, Oxfordshire, Reino Unido, Diamond Light Source Co., Ltd., Centro de Imagen Biológica Electrónica.
Aka complejo de cosecha de luz centro de reacción 1 (RC-LH1) ukaxa componente fotosintético núcleo ukawa bacterias fototróficas morados ukanakana. Jiwasaxa pä estructuras microscopía crio-electrónica ukanaka uñt’ayapxtha complejo RC-LH1 ukatxa Rhodopseudomonas palustris uksatxa. Aka 2,65-Å resolución estructura del complejo RC-LH114-W ukaxa 14 subunidad LH1 bucles ukanakampiwa RC muyuntki, ukaxa proteína W ukampiwa jark’ata, ukatxa complejo jan proteína-W ukampixa taqpacha RC composición RC ukampiwa muyuntata. Jist’antata 16 subunidad LH1 ukampi. Aka lurawinakampi chikachasiñaxa mä amuyt’awi churaraki dinámica de quinona uka complejo RC-LH1 uksanxa, ukaxa nayraqata jani amtatäki uka mayjt’awinaka conformacionales ukanakampi kunapachatixa quinona ukarux ligado RC QB uksanxa, ukhamaraki kawkhantixa utjki sitios de unión de quinona auxiliar ukanakaxa, ukaxa yanapt’iwa Pass them to RC. Aka proteína W uksa tuqita sapa mayni lurawixa jark’iwa LH1 uksa tuqita jist’antañataki, ukhamarusa mä canal uñstayaraki quinona/quinolona uksa tuqita jank’aki mayjt’ayañataki.
Fotosíntesis ukan ch’amapax niya taqpach aka Uraqin jakañapatakiw yanapt’aspa, ukat biotecnología solar ukatakix wali ch’amaniwa. Uraqpachan fotosíntesis ukar ch’amanchasa, bacterias fototróficas morados ukanakax kunayman modos energéticos ukat capacidades metabólicas ukanakaw uñacht’ayataraki. Jupanakaxa fotosíntesis uksa tuqita jark’aqasipxaspawa ukatxa ch’amakanxa bacterias heterotróficas ukhamjamawa jilxattaspa, nitrógeno ukatxa dióxido de carbono uksa askichapxaspawa, hidrógeno uksa lurapxaspaw, ukatxa compuestos aromáticos uksaruwa t’unjapxaspa (1-3). Uka lurawinakata ch’ama churañatakixa, qhanaxa jank’aki ukhamaraki suma ch’ama química ukar tukuyañawa. Aka lurawixa qalltasiwa kunapachatixa complejo de antenas trampas de luz ukaxa qhana ch’amthapi ukatxa transferencia energía atrapada ukaxa centro de reacción (RC) uksaru, ukhamarusa qalltaraki carga separación (4 – 7). Aka unidad básica de fotosíntesis ukaxa bacterias fototróficas morados uksanxa luratarakiwa tipo 2 RC, ukaxa muyuntata complejo de cosecha de luz 1 (LH1) ukampiwa, ukaxa lurasirakiwa complejo núcleo RC-LH1. LH1 ukaxa luratarakiwa mä matriz de heterodímeros αβ curvos ukanakampi, sapa maynixa pä clorofila bacteriana (BChl) a moléculas ukanakaru ukhamaraki mä jan ukaxa pä carotenoides ukanakaru uñtatawa (8-12). Aka antena LH1 ukaxa juk’ampi sapuru 16 jan ukaxa 17 heterodímeros αβ ukanakampiwa RC (9-13) ukar muyuntata mä jist’antata lazo ukanxa, ukampisa yaqha complejos núcleo ukanxa, péptidos transmembrana ukanakaxa LH1 muyuntata continuidad ukarux jark’aqi, Ukhamatwa difusión quinol/quinona RC ukat complejo citocromo bc1 ukanaka taypinxa ch’amanchasi (11, 13-15 ukat jukʼampi). Aka morado fototrófico planta Rhodopseudomonas (Rps.) ukaxa mä organismo modelo ukhamawa, ukaxa amuyaspawa energía ukhamaraki transferencia de electrones ukaxa fotosíntesis ukaru yanapt’i. Nayrïr estructura cristalina ukax Rps. Aka modelo del complejo palustris RC-LH1 ukaxa RC satawa, ukaxa 15 heterodiméricos LH1 bucles ukanakampi muyuntata, ukaxa mä jan uñt’ata proteína “Proteína W” sata ukampiwa jark’aqataraki (14). Ukxarusti proteína-W ukaxa RPA4402 ukjamawa uñt’ayataraki, ukaxa mä proteína 10,5kDa jan caracterizada ukhamawa kimsa hélices transmembrana predecidas (TMH) (16). Jiwasaxa amtapxtanwa suti mayjt’ayaña rpa4402 gen codificador proteína W ukatxa pufW ukhama nomenclatura apnaqata gen codificador RC-L, M (pufL, pufM) ukhamaraki LH1α, β (pufA, pufB) subunidades ukanakampi. Ukasti, proteína-W ukaxa niya 10% ukja RC-LH1 uksankiwa, ukaxa Rps. palustris ukaxa pä mayja complejos RC-LH1 ukanaka luraraki. Aka tuqinxa, yatiyapxaraktwa crio-EM (crio-EM) jach’a resolución ukanakampi pä complejos núcleos ukanakampi, maynixa proteína W ukhamaraki 14 heterodímeros αβ ukanakampi, maynixa jani proteína W ukampi ukhamaraki mä jist’antata 16 Heterodímeros LH1 bucle ukampi. Jiwasana lurawixa mä thakhi mayjt’awi uñacht’ayi aka amuyt’awina complejo RC-LH1 de Rps. palustris, kunatixa sapa variante ukana población homogénea uñakipatawa ukatxa suficiente resolución ukaniwa qhana asignar sapa péptido ukatxa pigmentos ligados ukatxa lípidos ukatxa quinonas relacionados. Aka lurawinakampi chikachasiñaxa uñacht’ayiwa kimsa proteínas TMH-W ukaxa janiwa yaqha complejo RC-LH1 ukanxa jichhakamaxa jikxataskiti, ukaxa mä canal de quinona uñstayi, ukhamata jank’aki intercambio quinona/quinolona. Mä qawqha sitios de unión lípido conservado ukhamaraki quinona ukanakaxa uñt’atarakiwa, ukatxa uñacht’ayapxaraktwa mä machaq mayjt’awi conformacional ukaxa quinona ukatxa RC ukanakampi mayachata ukxaruxa, ukaxa wali askïspawa fotosistema II (PSII) RC ukatakixa organismos fototróficos oxigenados ukanakataki. Jiwasana yatxatawinakaxa machaq amuyunaka churaraki cinética de unión de quinona/quinolona ukatxa intercambio ukatxa complejo núcleo RC-LH1 de bacterias fototróficas morados ukanakana.
Ukhamarusa, mä suma yatxatawi lurañatakixa pä complejos ukanakaxa jikxatasiwa Rps. palustris, sapa RC-LH1 ukaxa bioquímicos ukanakampiwa yaqhawjar jaqukipata. Aka complejo proteico W-deficiente (akaxa ΔpufW sata) ukjamaraki cepa ukjamaraki gen pufW ukampi (16) ukjamaraki, ukatxa mä complejo RC-LH1 ukakiw lurasispa. Aka complejo proteína W ukaxa mä cepa ukana luratawa. Aka cepa proteína W ukaxa mayjt’ayatarakiwa mä etiqueta His 10x ukampi C-terminal uksana, ukhamata complejo proteína W ukampi suma mayachasispa jilpacha falta proteína W ukampi metal inmovilización tuqi. Aka complejo ukaxa wali suma jaljatawa (16) Cromatografía de Afinidad (IMAC).
Kunjamatixa 1 uñacht ayata, panpacha complejos ukanakaxa kimsa subunidad RC (RC-L, RC-M ukatxa RC-H) ukanakampiwa muyuntata mä antena LH1 ukampiwa. Aka 2,80-A lurawixa aka complejo falta proteína-W ukjamaraki 16 heterodímeros αβ uñacht’ayi, ukaxa mä jist’antata LH1 bucle ukjamaraki taqpacha RC muytata, akaxa akaxa complejo RC-LH116 satawa. Aka 2,65Å ukjamaraki aka complejo proteína-W ukjamaraki 14 heterodímeros LH1 ukjamaraki proteína-W ukjamaraki interrumpida ukjamaraki RC-LH114-W ukjamaraki.
(A ukatxa B) Uraqina uñacht’ayawixa compuesto ukankiwa. (C y D) Pigmentos ligados ukanakaxa varilla ukanakampiwa uñacht’ayata. . complejo esfaeroides (13)) ukat juk’ampinaka. LH1-α uksa tuqita, subunidad proteica uksa tuqita saminakapaxa q’illu; LH1-β uksa tuqita, subunidad proteica uksa tuqita ch’uxña saminakawa; proteína-W ukatakixa, proteína ukaxa wila; RC-H ukatakixa, ukaxa cian satawa; RC-L ukatakix, ukax Naranja satawa; ukatakix RC-M, magenta. Cofactores ukaxa varillas ukanakampiwa uñacht’ayataraki, ch’uxñanakaxa BChl ukatxa BPh a moléculas ukanakampiwa uñacht’ayataraki, morado ukaxa carotenoides ukanakampiwa uñacht’ayataraki, ukatxa q’illuxa UQ10 moléculas ukanakampiwa uñacht’ayataraki. (G y H) Jach’aptayata uñjawi aka brecha proteína-W ukjamaraki región equivalente RC-LH114-W complejo (G) ukhamaraki complejo RC-LH116 (H). Cofactores ukaxa uñacht’ayatarakiwa espacio phuqantañataki, quinona quelado ukaxa ch’iyara uñacht’ayatawa. Aka proteína-W uksanxa ch’iyara ch’iyara ch’iyara chimpumpiwa (G) uñacht’ayataraki, ukatxa jisk’a p’iyanakaxa kawkhantixa quinona/quinolol ukaxa difundi LH116 anillo uksanxa ch’iyara ch’iyara chimpumpiwa (H) uñacht’ayataraki.
Figura 1 (A y B) uñacht’ayiwa RC muyuntata matrizes abierto jan ukaxa cerrado de heterodímeros LH1αβ, sapa maynixa pä BChl ukhamaraki mä carotenoide ukarux ligada (Figure 1, C y D). Nayra yatxatawinakax uñacht’ayiwa Rps ukax complejo LH1 ukawa. Aka biosintética thakhixa espirulina xantina uksanxa, aka especies ukanakaxa poblaciones mixtas de carotenoides ukanakampiwa (17). Ukampirusa, espiropirroxantina ukaxa carotenoide dominante ukhamaraki densidad ukaxa satisfactoria. Ukatwa, espiroxantina ukxa taqi LH1 ukar uñtañ chiqanakan modelo ukham lurañ ajlliwaytanxa. Aka polipéptidos alfa ukhamaraki beta ukaxa sapa TMH ukjamaraki jisk’a membrana anqäxa suyunakani (Figure 1, A, B, E, y F). Ukhamaraki, densidad de 17 residuos ukanakaxa C-terminal uksanxa janiwa uñjasiwaykiti, ukampirusa polipéptido alfa ukaxa Met1 uksatxa Ala46 uksaruwa ch’amanchataraki aka pä complejos uksana. Aka polipéptido β ukjamaraki Gly4 ukjamaraki Tyr52 ukjamaraki RC-LH116 ukjamaraki Ser5 ukjamaraki Tyr52 ukjamaraki RC-LH114-W ukjamaraki. Janiwa densidad 3 jan ukaxa 4 N-terminal jan ukaxa 13 C-terminal residuos uñakipatakiti (Figure S1). Análisis de espectrometría de masas ukaxa complejo RC-LH1 mixto wakicht’ata aka cepa de tipo salvaje uksatxa uñacht’ayiwa aka chhaqhata región ukaxa mä resultado de escisión heteróloga uka péptidos uksa tuqita (Figure S1 y S2). Ukhamaraki, formulación N-terminal de α-Met1 ukaxa uñjasiraki (f). Aka análisis ukjamaraki α-péptido ukaxa residuos fMet1 ukjamaraki Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ukjamaraki residuos Ser2 ukjamaraki Ala53 ukjamaraki, ukaxa suma acuerdo ukhamawa mapa de densidad EM baja temperatura ukampi.
Coordinación de α-His29 ukatxa β-His36 ukaxa BChls ukanakaruxa nayraqataru uñtatawa; sapa heterodímero αβ ukaxa jak’a masinakapampi tantachasi, mä jist’arat lazo (RC-LH114-W) jan ukaxa mä jist’antata (RC-LH116) lurañataki RC Uka excitón acoplado pigmento matriz (Figure 1, C y D). Aka 877 nm banda RC-LH114-W ukjamaraki 880 nm absorción wila desplazamiento RC-LH116 ukjamaraki 3 nm (Figure 2A). Ukampirusa, espectro dicroismo circular ukaxa niya kipkakiwa (Figure 2B), ukaxa uñacht’ayiwa qhana mayjt’awixa jist’arat ukhamaraki jist’antata lazos ukanakana, ukampirusa BChls ukana local medio ambiente ukaxa wali uñtasitawa. Aka desplazamiento rojo de absorción ukaxa lurasirakispawa jisk’achata movimiento térmico ukhamaraki jilxatata estabilidad ukampi jist’antata lazo (18, 19), mayjt’awi acoplamiento pigmento ukaxa lurasirakispawa jist’antata lazo (20, 21), jan ukaxa aka pä efectos ukanakampi mayachata (11).
(A) Espectro de absorción ultravioleta/visible/infrarrojo cercano, ukaxa picos ukanakaxa pigmentos correspondientes ukanakampiwa chimpuntata ukhamaraki normalizada pico BPh 775 nm uksana. (B) Espectro dicroismo circular normalizado ukhama BChl absorbancia 805 nm. (C y D) Ajlliri espectros ΔA ukaxa espectros de absorción tiempo-resolvido ukanakatxa complejo RC-LH114-W (C) ukhamaraki complejo RC-LH116 (D) ukanakatxa. Suma chiqaparu uñjañatakixa, taqi espectros ukanakaxa normalizados ukhamawa ∆A de −A ukjamaraki 0,2 ps. (E) Tasa de oxidación citocromo c2 ukjamaraki irradiación ukjamaraki kunaymana concentraciones de UQ2 ukjamaraki (uñxatma Figura S8 ukjamaraki datos crudos). . Nivel proteico ukaxa yatxatatarakiwa electroforesis de gel SDS-poliacrilamida ukhamaraki inmunoensayo tuqi (uñxatma Figura S9 ukaxa crudo uñakipañataki). Ukaxa mä ratio relativo ukhamawa purificado complejo RC-LH114-W ukampi. Aka relación estequiométrica RC-L ukjamaraki proteína-W ukjamaraki complejo ukjamaraki 1:1.
Aka BChls ukanakaxa 1 uksanxa deformado αβ14 bucle de RC-LH114-W (Figure 1, A, C, y E) uksanxa 6,8Å ukjawa RC primario donante (P) uksaruxa jak’achasi aka BChls equivalentes RC-LH116 uksanxa (Figure. 1, B, D, y F, y Figura S3); ukampisa, cinética de absorción transitoria ukaxa pä complejos uksanakanxa uñacht’ayiwa RC-LH114-W ukhamaraki RC-LH116 uksanakatakixa, constantes de tiempo de transferencia de energía excitación ukaxa LH1 uksatxa RC uksaruxa 40 ±4 ukhamaraki 44±3 ps ukjawa (Figure 2). , C ukatxa D, Figura S4 ukatxa Tabla S2). Ukhamaraki, RC uksanxa transferencia electrónica uksanxa janiwa mä jach a mayjt awixa utjkiti (Figure S5 y texto suplementario relacionado). Jiwasaxa suyt’tanwa, uka jak’a correspondencia de tiempo de transferencia de energía LH1 ukatxa RC-P ukampixa, ukaxa pachpa jaya, ángulo ukhamaraki energía potencial jilpacha BChl ukanakana pä lazos LH1 ukanakana. Ukhamarjamax patrón de energía LH1 ukar uñakipañax jisk’a distancia ukar puriñkamax janiw juk’amp jank’akïkiti, transferencia directa de energía ukarux sitios subóptimos ukanakat RC ukar puriñkama. Aka RC-LH114-W uksanxa LH1 bucle abierto ukaxa RC-LH114-W uksanxa mä movimiento térmico insignificante uksaruwa purirakispa condiciones de baja temperatura uksanxa análisis estructural uksanxa, ukatxa utjarakiwa mä conformación anillo αβ14 juk’ampi jaya temperatura ambiente uksanxa distancia de pigmentación βBChls uksanxa RC 1 uksanxa.
Aka complejo RC-LH116 ukaxa 32 BChls ukhamaraki 16 carotenoides ukanakampiwa, ukatxa taqpacha wakicht’awixa pachpakiwa aka Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Banco de Datos de Proteínas (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 cepa ( PDB ID 7C9R) (12) ukhamaraki ch’uxña algas (Blc.viridis) (ID PDB 6ET5) (10) ukanakampi. Uka alineación ukxaruxa, jisk’a desviaciones ukanakakiw uñjasiraki heterodímeros αβ ukanakan posición ukanakanxa, juk’ampirus 1-5, 15, 16 (Figure S6). Aka proteína-W uksa tuqita utjatapaxa wali sumawa LH1 uksa tuqita. Kimsa TMH ukaxa jisk’a lazos ukanakampiwa mayachataraki, N-terminal ukaxa complejo uksana lumen uksankiwa ukatxa C-terminal ukaxa citoplasmático uksankiwa (Figures 1A y 3, A a D). Proteína-W ukaxa jilpachawa hidrofóbica (Figure 3B), ukatxa TMH2 ukatxa TMH3 ukaxa LH1αβ-14 ukampi chikt’atawa mä superficie transmembrana uñstayañataki (Figure 3, B ukatxa E ukatxa G). Aka interfaz ukaxa jilpachaxa Phe, Leu ukatxa Val residuos ukanakampiwa lurataraki aka región transmembrana uksana. Aka residuos ukanakaxa aminoácidos hidrofóbicos ukhamaraki pigmentos αβ-14 ukanakampiwa pilata. Yaqhipa residuos polares ukaxa yanapt’arakiwa aka interacción ukaru, ukhamaraki hidrógeno enlace W-Thr68 ukhamaraki β-Trp42 ukanakampi aka compleja cavidad uksana (Figure 3, F y G). Aka citoplasma uksanxa, Gln34 ukaxa ceto grupo de carotenoides αβ-14 ukjamaraki. Ukhamaraki, n-dodecil β-d-maltósido (β-DDM) molécula ukaxa askichatarakiwa, ukatxa hidrofóbico chupa ukaxa jilxatarakiwa interfaz proteína-W ukatxa αβ-14 ukanaka taypina, ukatxa lípido chuymaxa inasa cuerpo ukanxa utjchispa. Ukhamaraki, uñjaraktanwa aka regiones de resolución C-terminal de proteína W ukatxa RCH ukaxa wali jak’ankiwa, ukampisa janiwa alcance de formar interacciones específicas ukanxa (Figure 1, A y E). Ukampirusa, aka pä proteínas ukanakana aminoácidos C-terminales janïra askichata ukanakana interacciones ukanakaxa utjaspawa, ukaxa mä mecanismo ukhamawa reclutamiento de proteína-W ukatakixa aka complejo RC-LH114-W ukana tantachawipana.
. (B) Proteína-W uñacht’ayata hidrofóbico saminakani. Áreas polares ukatxa cargadas ukanakaxa cian ukamp uñacht’ayatawa, áreas hidrofóbicas ukanakaxa janq’u uñacht’ayatawa, ukatxa áreas fuertemente hidrofóbicas ukanakaxa naranja uñacht’ayatawa. (C y D) Proteína-W uñacht’ayata dibujos animados ukanxa, orientación ukaxa pachparakiwa (A) (C), ukatxa 180° (D) ukjama muytata. Secuencian uñstawiparjamaxa, residuos distinguibles ukanakax arco iris colores ukaniwa, ukanx N-terminal ukax ch’uxña ukhamarak C-terminal ukax wila ukhamawa. (E) Proteína-W ukaxa pachpa uñjawimpiwa (A) uñakipata, ukatxa residuos ukanakaxa interfaz de proteína-W:LH1 uksanxa varias ukanakampiwa uñacht ayata, ukaxa chimpunakampi chikt ata. (F) Proteína-W ukjamaraki 90° ukjamaraki (E) ukjamaraki LH1αβ14 ukjamaraki caricatura ukjamaraki residuos de interfaz ukjamaraki barra ukjamaraki. Uka residuos sobresalientes ukaxa polipéptido beta uksatxa uñt’atawa. Aka cofactor ukaxa mä barra ukjamaraki 1 uñacht’awina saminakapampi chika uñacht’ayatawa, β-DDM descompuesto ukaxa gris uñacht’ayatawa, ukatxa oxígeno ukaxa wila uñacht’ayatawa. (G) (F) uksankiri uñjawixa 180° ukjamawa muytayata, ukaxa residuos prominentes ukanakampiwa polipéptido alfa etiquetado ukampi.
Proteína-W ukaxa mä heterodímero αβ uksaruwa lantinti (15 uñacht’awina 1F uñacht’awina), ukhamarusa jark’aqi lazo jist’antawi ukhamaraki inclina nayrïri kimsa heterodímeros αβ. Uñakipatarakiw ángulo máximo de inclinación nayrïr heterodímero αβ-1 relativo al película normal ukaxa 25° a 29° (Figure 1, A y E), ukaxa luratarakiwa 2° a 8° inclinación de αβ-1 en RC A agudo contraste-LH116 (Figure 1, B y F). Payïri ukhamaraki kimsïri heterodímeros ukanakaxa 12° a 22° ukhamaraki 5° a 10° ukjamawa. Ukhama jark’awi estérico RC ukjamaraki, inclinación αβ-1 ukaxa janiwa payïri par αβ (ukaxa 16 αβ ukarjamawa 1F uñacht’awina), ukhamarusa mä qhana ch’uqi LH1 anillo ukanxa (Figure 1, A y E) . Pä heterodímeros αβ jan utjatapatxa, pusi BChl ukhamaraki pä carotenoides chhaqhatampi chikt’ata, janiwa mayni carotenoides ukanakaxa subunidad αβ-1 torcida ukarux ligadokiti, ukatxa mä anillo LH114-W ukaw utjaraki, ukaxa 13 carotenoides Vegetariano ukhamaraki 28 BChls ukanakampiwa. Aka pä complejos ukanakana resolución local ukanakaxa αβ1 ukatxa 7 suyunakanxa juk’ampi jisk’akiwa, ukaxa LH1 bucle uksankirinakata sipansa juk’ampi jisk’akiwa, ukaxa inasa plasticidad inherente subunidad LH1 uksa tuqita RC QB uksa tuqiru jak’achata uñacht’ayaspa (Figure 4) .
Aka RC-LH114-W (A ukatxa B) ukhamaraki RC-LH116 (C ukatxa D) ukanakana jamuqanakaxa uñacht ayatawa pachpa pata tuqita/lado uñakipaña (A ukhamaraki B) (A ukatxa C) ukhamaraki cavidad superficie Fig. 1. (B ukatxa D). Saminakan llavenakapax ch’iqa tuqin uñacht’ayatawa.
Aka sapa mayni complejo núcleo característica ukaxa mä relación estequiométrica 1:14 ukjamaraki Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dímero (13). Ukampirusa, proteína W ukatxa PufX ukaxa janiwa qhana homología ukankiti, ukatxa mä jach’a impacto ukaniwa sapa mayni LH1 estructuras ukanakaru. PufX ukaxa mä sapa TMH ukhamawa mä dominio citoplasmático N-terminal ukampi ukaxa interactúa lado citoplasmático de la subunidad RC-H (13) ukampi mä posición correspondiente a Rps. palustris LH116αβ-16 ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. PufX ukaxa mä canal lurarakiw intercambio quinona/quinolona ukataki RC-LH1 ukampi complejo citocromo bcl ukampi ukatxa taqpacha Rba uksanwa utji. esfaeroides núcleo complejo (13) ukampi. Ukhamaraki, interfaz monómero-monómero ukaxa Rba. Aka esferoides RC-LH1-PufX dímero ukaxa jikxatasiwa aka posición de unión de proteína W ukjamaraki RC-LH114-W uksana, ukatxa aka brecha inducida PufX ukhamaraki proteína-W ukjamaraki mä posición equivalente uksana (Figure S7A). Aka ch’usa RC-LH114-W uksanxa alineada ukhamaraki hipotético canal de quinona (8) de Pseudomonas rosea LH1, ukaxa luratarakiwa péptidos ukanakampi jani proteína W jan ukaxa PufX ukanakampi (Figure S7B). Ukhamarus, canal de quinona ukax Blc. Aka esmeralda ch’uxña LH1 ukaxa luratarakiwa mä subunidad γ (7) ukjamaraki mä uñtasita chiqana (Figure S7C). Ukhamaraki, kunaymana proteínas ukanakampi mediados ukhama, aka canales de quinona/quinolol ukanaka uñstatapaxa mä posición común ukanxa complejo RC-LH1 uksanxa mä uñacht’awi evolución convergente ukhamawa, ukaxa uñacht’ayiwa aka brecha lurata proteína W ukaxa mä canal de quinona ukhamawa.
Aka ch’usawjaxa LH114-W uksanxa mä región de membrana continua uksa lurañatakixa espacio interno del complejo RC-LH114-W ukatxa membrana a granel uksa taypina (Figure 1G), janiwa pä dominios ukanakaxa mä poro proteico tuqi mayachañakiti kunjamatixa proteínas uksanxa ukhama. Aka complejo RC-LH116 ukaxa mä jist’antata Tch. Complejo aguja ukar uñtasita (22) (Figure 1H). Kunjamatixa difusión de quinona ukaxa membrana tuqixa juk’ampi jayaruwa puriraki aka canal estrecho proteico tuqi difusión ukatxa, aka jist’arat LH114-W bucle ukaxa permitispawa juk’ampi jank’aki RC turno ukaxa jist’antata LH116 lazo ukatxa, ukatxa difusión de quinona ukaxa RC uksanxa juk’ampi jark’atarakispawa. Uka yant’añatakixa proteína W ukaxa afectarakiwa conversión de quinonas RC tuqi, lurapxaraktwa mä ensayo de oxidación citocromo ukaxa mä juk’a concentración de ubiquinona 2 (UQ2) (mä análogo de UQ10 natural con una cola de isopreno más corta) (Figure 2E). Ukhamaraki, quinona quelado ukan utjatapaxa jark’iwa chiqapa determinación de constante Michaelis aparente (RC-LH114-W ukhamaraki RC-LH116 ukaxa wali askiwa 0,2±0,1μM ukhamaraki 0,5±0,2μM, ukjamaraki), aka tasa máxima RC-LH114-W ( 4,6±0,2 e-RC-1 s-1) ukjamaraki 28±5% ukjawa RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) ukjamaraki.
Qalltanxa amuyapxaraktwa proteína-W ukaxa niya 10% ukja complejo núcleo uksana (16); aka tuqinxa, tasas de ocupación de células de crecimiento de baja luz, mediana luz, y alto luz ukaxa 15±0,6%, 11±1% ukhamaraki 0,9±0,5, ukjamaraki % (Figure 2F). Comparación cuantitativa de espectrometría de masas uñacht’ayiwa aka etiqueta histidina uksa yapxatawixa janiwa jisk’achakiti aka abundancia relativa de proteína-W ukjamaraki cepas de tipo salvaje ukanakampi chikachasiñataki (P = 0,59), ukhamarusa aka niveles ukaxa janiwa artefacto de proteína-W modificada ukjamaraki (Figure S10). Ukampirusa, aka jisk’a ocupación de proteína-W ukaxa complejo RC-LH1 uksanxa yaqhipa RCs ukanakaruxa mä ritmo acelerado ukanwa flip uñacht’ayaspa, ukhamata juk’ampi llamp’u intercambio de quinona/quinolona complejo RC-LH116 uksanxa. Jiwasaxa uñjtanwa aka jach’a tasa de ocupación de luz ukaxa janiwa chiqapakiti aka qhipa transcriptómica ukanxa, ukaxa uñacht’ayiwa expresión génica pufW ukaxa jilxatiwa ch’amani qhanampi (Figure S11) (23). Aka mayjt’awixa transcripción pufW ukatxa proteína-W uksa tuqita aka complejo RC-LH1 uksanxa wali ch’amawa ukatxa inasa uñacht’ayarakchispa aka regulación compleja de la proteína.
Aka RC-LH114-W uksanxa, 6 cardiolipina (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) ukhamaraki 29 moléculas β-DDM ukanakaxa asignada ukhamaraki modelada ukanxa 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs ukhamaraki 12 βDDMs. RC-LH116 (5, A ukatxa B uñacht’awi). Aka pä lurawinxa, CDL ukaxa niyawa citoplasmático uksana jikxatasi, ukatxa POPC, POPG ukatxa β-DDM ukaxa jilpachaxa luminal uksankiwa. Pä moléculas lípidas ukhamaraki detergentes ukanakaxa apsutarakiwa aka αβ-1 a αβ-6 ukjamaraki aka complejo RC-LH114-W uksana (Figure 5A), ukatxa phisqaxa apsutarakiwa aka región equivalente RC-LH116 uksana (Figure 5B ). Jila lípidos ukanakaxa jikxatasiwa mayni lado complejo uksana, jilpachaxa CDL, ukanakaxa tantachatarakiwa RC ukatxa αβ-7 uksatxa αβ-13 uksakama (Figure 5, A y B). Yaqha lípidos estructuralmente resueltos ukatxa detergentes ukanakaxa LH1 anillo anqäxaru uñtatawa, ukatxa cadenas acil suma resolución ukanakaxa subunidades LH1 ukanaka taypinwa jilxati, tentativamente uñt’atarakiwa β-DDM ukhama RC-LH114-W uksanxa, ukatxa definida ukhama β-DDM ukhama RC A mezcla de β-DDM ukatxa POPC-LH116 uksanxa. Jiwasana estructura ukanxa lípidos quelantes ukatxa detergentes ukanakana uñtasita posición ukanakaxa uñacht’ayiwa fisiológicamente relevantes sitios de unión (Figure S12A). Ukhamaraki Tch uksanxa moléculas equivalentes ukanakana posición ukanakaxa suma consistencia ukaniwa. Llamp’u ukat Trv. Aka cepa 970 RC-LH1s (Figure S12, B a E) (9, 12) ukhamaraki residuos de unión hidrógeno ukjamaraki lípido p’iqi qutuxa uñacht’ayapxiwa mä suma conservación aka alineación de secuencias uksana (Figure S13), ukaxa uñacht’ayiwa aka CDL Conservado ukaxa RC (24) uksaru ligado, aka sitios ukaxa conservados ukhamawa complejo RC-LH1 uksana.
. UQ RC QA ukat QB ukan chiqanakar chint’atax q’illuwa, ukatx UQ aislado ukax ch’uxñakiwa. (C ukatxa D) Pachpa uñjawinaka (A) ukhamaraki (B), lípidos ukanakaxa janiwa utjkiti. (E a G) Jach’a uñjawi Q1(E), Q2(F) ukhamaraki Q3(G) RC-LH116 uksatxa, cadenas laterales ukanakampiwa maynit maynikama ch’amanchasipxi. Hidrógeno ukan enlaces ukanakax ch’iyar ch’iyar ch’iyar chimpunak uñacht’ayatawa.
RC-LH116 uksanxa, RC QA ukhamaraki QB UQ, ukanakaxa transferencia de electrones uksanxa chikañchasipxiwa proceso de separación de carga uksanxa, ukanakaxa descompuestos ukhamawa sitios de unión ukanakana. Ukampirusa, RC-LH114-W uksanxa, QB quinona ukaxa janiwa askichatäkiti, ukatxa akhamawa juk’ampi yatxatatarakini. Ukhamaraki, QA ukhamaraki QB quinonas ukjamaraki, pä moléculas UQ queladas (uñt’atanaka RC ukhamaraki LH1 anillo ukanaka taypina) ukanakaxa RC-LH114-W ukana estructura ukanxa suma askichata p’iqi qutuchataparjamawa (Q1 ukhamaraki Q2 uksana utji, ukjamaraki). ispasyu). Figura 5C). Pä unidades isopreno ukanakaxa Q1 uksaruwa churataraki, ukatxa mapa de densidad ukaxa Q2 uksanxa 10 isopreno colas completas ukanakawa askichataraki. Aka RC-LH116 uksanxa, kimsa moléculas queladas UQ10 (Q1 a Q3, Figura 5D) ukanakawa askichataraki, ukatxa taqpacha moléculas ukanakaxa qhana densidad ukaniwa taqpacha chuymampi (Figure 5, D a G). Pä lurawi taypinxa, Q1 ukatxa Q2 uksana quinona p’iqi qutuchata chiqanakaxa wali sumawa (Figure S12F), ukatxa RC ukampikiwa chikañchasipxi. Q1 ukaxa RC-LH114-W uksana W gap uksana mantaña chiqana (Figure 1G y 5, C, D y E), ukatxa Q2 ukaxa QB uksa tuqiru uñtatawa (Figure 5, C, D) ukhamaraki F). Aka conservados L-Trp143 ukhamaraki L-Trp269 residuos ukaxa wali jak’ankiwa Q1 ukhamaraki Q2 ukjamaraki potenciales interacciones π-apilamiento (Figure 5, E y F, y Figura S12). L-Gln88, 3,0 Å ukja oxígeno distal Q1 uksatxa, mä ch’amani hidrógeno uksa tuqita (Figure 5E); aka residuo ukaxa taqpacha RCs ukanakanwa jark’aqataraki jan ukaxa juk’ampi jaya pachanakanxa (Figure S13). L-Ser91 ukaxa conservadormente sustituido Thr ukjamaraki jilpacha yaqha RCs uksana (Figure S13), 3,8 Angstroms ukjamaraki oxígeno metilo Q1 uksatxa, ukatxa inasa jan ch’amani enlaces de hidrógeno uksa tuqita (Figure 5E). Q3 ukaxa janiwa mä específica interacción ukankiti, jan ukasti región hidrofóbica uksanwa jikxatasi subunidad RC-M ukatxa subunidad LH1-α 5 ukatxa 6 uksana (Figure 5, D y G). Q1, Q2 ukatxa Q3 jan ukaxa jak’a quinonas queladas ukanakaxa Tch. Llamp’u chuymani, Trv. Cepa 970 ukat Blc. Aka estructura iris (9, 10, 12) ukaxa uñacht’ayiwa mä conservado sitio de unión de quinona auxiliar aka complejo RC-LH1 uksana (Figure S12G). Aka phisqa UQs descompuestos RC-LH116 uksanxa suma acuerdo ukhamawa 5,8±0,7 sapa complejo ukjamaraki cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) ukjamaraki, ukatxa kimsa UQs descompuestos RC-LH114-W uksanxa juk’ampi jisk’akiwa Aka valor medido de 6,2±0,3 (Fig. S14) uñacht’ayiwa kunatixa utjiwa moléculas UQs janïra askichata aka estructura uksana.
Aka polipéptidos pseudosimétricos L ukhamaraki M sapa maynixa phisqa TMHs ukanakampiwa lurataraki, ukaxa mä heterodímero ukjamaraki mä dímero BChl, pä monómeros BChl, pä monómeros bacteriófagos (BPh) ukanakampi mayachata, ukhamaraki mä hierro no Heme ukampi mä jan ukaxa pä moléculas UQ10 ukanakampi. Aka hidrógeno enlaces ukanaka utjatapata aka grupo cetona terminal uksana ukhamaraki uñt’ata acumulación Rps uksana, carotenoides ukanakaxa M-subunidad uksanxa mantarakiwa, ukaxa cis-3,4-deshidroorhodopina satawa. Ukaxa (25). Aka dominio de membrana exterior de RC-H ukaxa anclado ukhamawa membrana ukarux mä sapa TMH ukampiwa. Taqi RC ukan lurawipax kimsa subunidad RC ukar uñtasitawa, ukax especies relacionadas (kunjamakitix Rba) ukanakampi. esferoides (ID PDB: 3I4D) ukanakampi. Aka macrociclos de BChl ukatxa BPh, columna vertebral carotenoide ukatxa hierro no heme ukaxa aka estructuras ukanakana resolución ukanxa uñakipatawa, ukhamaraki UQ10 p’iqi qutuxa QA uksanxa ukhamaraki QB quinona RC-LH116 uksanxa (Figure S15).
Pä estructuras RC ukan utjatapaxa kunaymana tasas de ocupación de sitio QB ukanakampiwa machaq oportunidad uñacht’ayi, ukhamata uñakipañataki mayjt’awinaka conformacionales constantes ukanakaxa QB quinona ukar uñtatawa. Aka complejo RC-LH116 uksanxa, QB quinona ukaxa jikxatasiwa taqpacha ligado “proximal” uksana (26), ukampisa separación de RC-LH114-W ukaxa janiwa QB quinona ukampi utjkiti. RC-LH114-W uksanxa janiwa QB quinona ukaxa utjkiti, ukaxa muspharkañawa kunatixa complejo ukaxa activo ukhamawa, juk’ampi complejo RC-LH116 ukatxa estructuralmente resolución QB quinona ukampi. Ukhamaraki, pä anillo LH1 ukanakaxa niya suxta quinonas quelata ukhamawa, phisqaxa estructuralmente resolvedas ukhamawa jist’antata anillo RC-LH116 uksanxa, ukatxa kimsakiwa estructuralmente limitados ukhamawa anillo abierto RC-LH114-W uksanxa . Aka jilxatata trastorno estructural ukaxa uñacht’ayaspawa juk’ampi jank’aki turkakiptawi RC-LH114-W QB chiqanakaru, juk’ampi jank’aki cinética de quinona complejo ukanxa, ukhamaraki jilxatata probabilidad de cruzar la bucle LH1. Jiwasaxa amuyt’tanwa, UQ jan utjatapaxa RC-LH114-W uksana RC QB uksana, ukaxa mä complejo juk’ampi complejo ukhamaraki activo uksana, ukatxa QB uksana RC-LH114-W uksana jank’aki congelado ukhamawa UQ turnover uksanxa Etapa específica (QB uksaru mantañaxa jist’antatawa) uñacht’ayiwa conformación de esta actividad.
Jani QB ukampixa, L-Phe217 ukampi chikt’ata turkakipawixa mä posición ukaruxa janiwa compatible ukhama UQ10 ukanxa, kunatixa mä colisión espacial ukaw utjani nayrïri unidad isopreno ukampixa chuymampi (Figure 6A). Ukhamaraki, qhana jach’a mayjt’awinakaxa conformacionales ukanakaxa qhanawa, juk’ampirusa hélice de (hélice corto en el bucle entre TMH D y E) kawkhantixa L-Phe217 ukaxa mayjt’ayatarakiwa bolsillo de unión QB ukaru ukhamaraki turkakipäwi L-Tyr223 (Figure 6A ) Aka enlace hidrógeno ukaxa marco M-Asp45 ukampi p’akintañataki ukhamaraki jist’antañataki mantañataki sitio de unión QB (6B uñacht’awi). Hélice de pivotas ukaxa base uksanxa, Cα de L-Ser209 ukaxa 0,33Å ukjamawa mayjt’ayataraki, ukatxa L-Val221Cα ukaxa 3,52Å ukjamawa mayjt’ayataraki. Aka TMH D ukatxa E uksanxa janiwa mayjt’awinakaxa uñjasiwaykiti, ukaxa superponible ukhamawa pä lurawi taypina (Figure 6A). Kunjamtï yattanxa, akax nayrïr estructura RC natural ukanx QB ukan chiqawj jist’antatawa. Mä chiqanchawi phuqhata (QB-bound) lurawimpixa uñacht’ayiwa janïra quinona uksa jisk’achatäkipana, mä cambio conformacional ukawa wakisi quinona uksaru mantañapataki. L-Phe217 ukaxa muyunti mä interacción π-apilamiento lurañataki quinona p’iqi qutumpi, ukatxa hélice ukaxa anqäxaru mayjt’ayaraki, ukhamata esqueleto L-Gly222 ukatxa cadena lateral de L-Tyr223 ukaxa mä red de enlace hidrógeno lurañataki mä estructura estable de enlace hidrógeno ukampi (Figure 6, A y C).
(A) Caricatura superpuesta de holograma (cadena L, cadena naranja/M, magenta) ukhamaraki estructura apo (gris), ukanxa residuos clave ukanakaxa uñacht’ayatawa mä representación varilla ukhamjama. UQ10 ukax q’illu ch’iyar ch’iyar uñacht’ayatawa. Punto chimpunakax taqpach estructura ukan hidrógeno ukan enlaces ukanakap uñacht’ayi. (B y C) Aka representación superficial de la apolipoproteína ukatxa taqpacha anillo estructura, uñacht’ayatarakiwa oxígeno de cadena lateral de L-Phe217 ukaxa ch’iyara ukhamaraki L-Tyr223 ukaxa wila, ukjamaraki. Subunidad L ukax naranja satawa; subunidades M ukat H ukanakax janiw colores ukankiti. (D y E) Apolipoproteína (D) ukhamaraki taqpacha (E) RC QB chiqanaka [color por (A) ukjamaraki Thermophilus thermophilus PSII (ch’uxña, ch’uxña quinona plástica ukampiwa; PDB ID: 3WU2) Alinear (58).
Jan suyt’ata, walja estructuras de RCs deficientes QB jan LH1 ukampi utjkchisa, aka yatxatawinxa uñjata mayjt’awinakaxa conformacionales ukanakaxa janiwa nayraqata yatiyatäkiti. Ukanakax QB depleción ukan estructurapawa Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch., ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) ukatxa Rba. esfaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), taqi ukanakaxa niya kipkakïpxiwa taqpacha QB ukana lurawipampi. 3PRC uksa tuqita suma uñakipañaxa uñacht’ayiwa LDAO (Óxido de Lauryl Dimetil Amina) detergente moléculas ukanakaxa QB uksa tuqiru mantañatakixa ligado ukhamawa, ukaxa jark’aqaspawa mayampi wakicht’añataki mä jist’antata conformación ukarjama. LDAO ukaxa janiwa pachpa chiqana 1EYS jan ukaxa 1OGV uksanxa ch’amakt’kiti, ukampirusa aka RCs ukaxa pachpa detergente ukampiwa wakicht’ata ukatxa ukaxa pachpa efectos uñstayaspa. Uka cristal ukanxa Rba. Sphaeroides RC co-cristalizadas con citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) ukaxa mä jist’antat QB ukana uñt’atarakiwa. Ukampirusa, aka tuqinxa, región N-terminal ukaxa polipéptido RC-M (interactúa con el sitio de unión QB a través del enlace H del residuo Tyr en el hélice Q) ukaxa apsuwayiwa mä conformación no natural, ukatxa mayjt’awi conformacional QB ukaxa janiwa juk’ampi yatxatatäkiti (30 ). Kunatix chuymacht’ki ukax janiw uñjktanti aka kasta deformación polipéptido M uksanxa RC-LH114-W uksanxa, ukaxa niya kipkarakiwa región N-terminal RC-LH116 RC uksanxa. Ukhamaraki, amuyañawa, antena LH1 basada en detergente uksa chhaqtayatatxa, PDB uksanxa RCs apolipoproteínas ukanakaxa askichatarakiwa, ukaxa chhaqtayatarakiwa piscinas de quinona internas ukatxa lípidos ukanakaxa RC uksana ukhamaraki manqha tuqina anillo LH1 uksana (31, 32). RC ukaxa lurasirakiwa kunatixa taqpacha cofactores ukanakaxa katxaruwayi, jan ukasti quinona QB descomponible ukampi, ukaxa janiwa sinti ch’amanchatäkiti ukatxa walja kutiwa chhaqhi wakicht’aña pachana (33). Ukhamaraki, yatisirakiwa LH1 ukatxa lípidos cíclicos naturales uksa RC uksatxa apsuñaxa mä impacto ukaniwa funciones ukanakaru, kunjamatixa jisk’achata jakawipaxa carga-separado P+QB-estado (31, 34, 35). Ukatwa, RC ukar muyuntat anillo local LH1 ukan utjatapax “jist’antat” QB ukan chiqaparux uñjaspawa, ukhamat QB jak’an local medio ambiente ukarux jark’aqaspa sasaw amuyt’apxta.
Ukhamaraki, apolipoproteína (janiwa QB quinona ukampi) ukhamaraki taqpacha estructura ukaxa pä instantáneas ukaki uñacht’ayi turno del sitio QB ukatxa, janiwa mä serie de eventos ukhamakiti, ukampirusa uñacht’awinakaxa utjarakiwa aka unión ukaxa gated ukhamawa jani mayampi ligado ukaxa hidroquinona ukampi jark’aqañataki inhibición de sustrato. Quinolol ukat quinona ukanakan mayacht’asiwipax apolipoproteína ukan QB ukan jak’anx mayj mayjawa, ukax RC ukan jan iyawsäwiparuw puriyi. Nayratpachaw amuyasi, cambios conformacionales ukax mä rol ukaniwa quinonas ukanakan unión ukhamarak reducción ukanakan. Aka RCs congelados ukaxa quinonas uksa jisk’achañatakixa ch’amaka adaptación ukxaruxa jan walt’ayatarakiwa (36); Cristalografía de rayos X uñacht’ayiwa aka jan walt’awixa quinonas QB ukanakampiwa katjataraki mä conformación “distal” ukanxa niya 4,5 Å ukharu posición proximal activa ukata (26) , 37). Jiwasaxa amuyt’tanwa aka conformación de unión distal ukaxa mä instantánea estado intermedio ukanxa apolipoproteína ukatxa estructura de anillo completo ukanakampi, ukaxa arktasiwa qallta interacción quinona ukampi ukhamaraki jist’arawi sitio QB ukampi.
Aka RC tipo II ukaxa jikxatasiwa complejo PSII uksana yaqhipa bacterias fototróficas ukatxa cianobacterias, algas ukatxa quqanakata conservación estructural ukhamaraki funcional (38). Aka alineación estructural uñacht’ayata Figura 6 (D y E) ukanxa uñacht’ayiwa PSII RCs ukanakampi ukhamaraki sitio QB ukampi complejo RC bacteriano ukanakampi chikachasiña. Aka chiqanchawix nayratpachaw mä modelo ukhamawa sistemas cercanos relacionados de quinona de unión y reducción ukanakat yatxatañataki. Nayra qillqatanakaxa uñacht’ayiwa mayjt’awinaka conformacionales ukaxa PSII reducción de quinonas ukampi chikt’ata (39, 40). Ukhamarusa, RC uksa tuqita evolutiva conservación uksa tuqita amuyt’asaxa, aka mecanismo de unión nayraqata jani uñjata ukaxa PSII RC uksana QB uksa tuqiruxa fototróficos oxigenados uksanakanxa apnaqatarakiwa.
Rps ΔpufW (deleción pufW no etiquetada) ukhamaraki PufW-His (C-terminal 10x His-etiquetado proteína-W expresada del locus natural pufW) cepas. palustris CGA009 ukaxa nayra lurawinakasaxa qhananchatawa (16). Aka cepas ukatxa isogénico awki tayka salvaje ukaxa apsutarakiwa congelador uksatxa mä jisk’a celulas ukanakampi rayachata PYE (sapa 5 g litro -1) (almacenada en LB a -80 °C, ukaxa 50% ( p/v) proteína de glicerol), extracto de levadura ukhamaraki succinato) placa agar [1,5% (p/v)] ukjamaraki. Aka placa ukxa ch’amakanxa mä arumawa incubada temperatura ambiente ukjamaraki condiciones anaeróbicas ukjamaraki, ukxaruxa qhant’ayatarakiwa janq’u qhanampi (~50 μmolm-2 s-1) uñacht’ayata OSRAM 116-W bombillas halógenos (RS Components, Reino Unido) ukanakampi 3 a 5 urunakata mä sapa colonia uñstañakama. Mä sapa colonia ukjamaraki 10 ml de medio M22+ (41) ukjamaraki 0,1% (p/v) ácidos de casamino (akatxa M22 satawa) ukjamaraki. Aka cultivo ukxa yapuchatarakiwa jisk’a oxígeno ukjamaraki ch’amakanxa 34 °C ukjamaraki ch’allt’ata 180 rpm ukjamaru 48 horas ukjamaru, ukxaruxa 70 ml ukjamaraki cultivo ukjamaraki inculcado ukjamaraki pachpa condiciones ukjamaraki 24 horas ukjamaru. Mä cultivo semiaeróbico mä volumen 1 ml ukjamaraki inoculación 30 ml de medio M22 ukjamaraki 30 ml universal tornillo-top transparente botella de vidrio ukjamaraki irradiada agitación (~50μmolm-2 s-1) 48 horas de fuerza magnética estéril Barra de agitación. Ukxarusti 30 ml ukjamaraki cultivo ukjamaraki niya 1 litro ukjamaraki cultivo ukjamaraki inoculación ukjamaraki 9 litro ukjamaraki cultivo ukjamaraki ~200 μmolm-2 s-1 ukjamaraki 72 horas ukjamaraki. Aka celulanakaxa apthapitawa centrifugación 7132 RCF 30 minutos ukjamaru, resuspendida ~10 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8,0), ukatxa -20 °C ukjamaru imatarakiwa wakisipana.
Uka descongelación ukxaruxa, mä qawqha cristales de desoxirribonucleasa I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) ukhamaraki pä tabletas inhibidora de proteasa de holoenzima Roche (Merck, Reino Unido) ukanakampiwa yapxatataraki aka células resuspendidas ukanakaru. Mä célula de presión francesa 20.000 psi (Aminco, EE.UU.) ukanxa, celulanakaxa 8 ukhamaraki 12 kutiwa ch’axwataraki. Ukxarusti janïra p’akjata celulas ukhamaraki residuos insolubles ukjamaraki centrifugación 18.500 RCF 15 minutos 4 °C ukjamaru apsutarakiwa, ukatxa membrana ukaxa precipitada lisado pigmentado ukjamaraki centrifugación 113.000 RCF 2 horas 43.000 °C ukjamaru. Aka fracción soluble ukxa jaqukipaña ukatxa resuspendir la membrana colorida 100 a 200 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ukjamaraki homogeneización ukjamaraki jani uñjkaya agregados ukanaka utjañapataki. Aka membrana suspendida ukxa incubada 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, EE.UU.) ukjamaraki 2% (p/v) β-DDM ukjamaraki 1 hora ch’amakaru 4 °C ukjamaraki llamp’u chuymampi ch’allt’ata. Ukxarusti centrífuga 70 °C ukjamaru 150.000 RCF 4 °C ukjamaru 1 hora ukjamaru ch’amanchañataki residual insolubles uksa apsuñataki.
Aka membrana solubilizante aka cepa ΔpufW uksatxa apsutarakiwa mä columna de intercambio de iones DEAE Sepharose 50 ml ukjamaraki kimsa volúmenes de columna (CV) de tampón de unión [20 mM tris-HCl (pH 8,0) ukjamaraki 0,03% (p / v) β-DDM]. Aka columna ukxa pä tampón de unión CV ukampiwa jariqataraki, ukxaruxa columna ukxa pä tampón de unión ukampiwa jariqataraki, ukaxa 50 mM NaCl ukaniwa. Aka complejo RC-LH116 ukaxa eluido ukhamawa gradiente lineal 150 a 300 mM NaCl (en tampón de unión) 1,75 CV uksana, ukatxa qhipa complejo de unión ukaxa eluido ukhamawa mä tampón de unión ukampi 300 mM NaCl ukampi 0,5 CV uksana. Aka espectro de absorción 250 ukhamaraki 1000 nm ukjamaru apthapita, fracción con relación de absorbancia (A880/A280) 1 ukjata jila 880 a 280 nm ukjamaru, pä kuti diluir tampón de unión uksana, ukatxa pachpa lurawimpiwa mayampi apnaqaña columna DEAE On purification. Aka fracciones ukanakaxa A880/A280 ukjamaraki 1,7 ukjata jila ukhamaraki A880/A805 ukjamaraki 3,0 ukjata jila, ukjamaraki kimsïri muyu intercambio de iones ukjamaraki fracciones ukanakaxa A880/A280 ukjamaraki 2,2 ukjamaraki A880/A805 ukjamaraki 5,0 ukjamaraki. Aka complejo parcialmente purificado ukaxa concentrado ~2 ml ukjamaraki filtro centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, Reino Unido), ukjamaraki cargada mä columna de exclusión tamaño Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) ukjamaraki 200 mM tampón NaCl ukjamaraki, ukxaruxa eluido ukhamawa pachpa tampón 1,5 CV. Aka fracción de exclusión de tamaño uksa tuqita espectros de absorción uksa apthapiñawa, ukatxa concentración de espectros de absorción uksa tuqita A880/A280 uksa tuqita 2,4 uksa tuqita ukhamaraki A880/A805 uksa tuqita 5,8 uksa tuqita 100 A880 uksa tuqita, ukatxa jank’akirakiw rejilla crio-TEM uksa tuqita wakicht’aña jan ukaxa imaña Uñakipaña -80°C uksana wakisipana.
Aka membrana solubilizante cepa PufW-His uksatxa apsutarakiwa 20 ml columna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8,0) ukjamaraki 200 mM NaCl ukhamaraki 0,03% (p/p)) tampón IMAC ( GE Healthcare) ukjamaraki. v) β-DDM ukat juk’ampinaka]. Aka columna ukxa phisqa CVs de tampón IMAC ukampiwa jariqataraki, ukxaruxa phisqa CVs de tampón IMAC ukampiwa jaqukipataraki 10 mM histidina ukampi. Aka complejo núcleo ukaxa eluido columna uksatxa phisqa tampón IMAC ukanakampiwa 100 mM histidina ukampi. Aka fracción ukaxa complejo RC-LH114-W ukjamaraki ~10 ml ukjamawa mä tanque agitado ukjamaraki filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, Reino Unido) ukjamaraki diluida 20 ukja tampón de unión ukampiwa, ukxaruxa 25 ml ukjamawa yapxatatarakiwa Columna DEAE Sepharose uksanxa, pusi CVs ukanakaxa tampón ukarux ligado ukhamawa nayraqata apnaqatarakiwa. Aka columna ukxa pusi tampón de unión CV ukampiwa jariqataraki, ukxaruxa elución del complejo llätunka CVs ukjamaraki gradiente lineal 0 a 100 mM NaCl (en tampón de unión), ukatxa qhipa pusi CVs ukaxa 100 mM tampón de unión ukampi Aka complejos residual eluidos en el cloruro de sodio combinado con el relación A880/A280 mayor de 2,4 y el Aka A880/A805 ukjamaraki 4,6 fracciones ukjamaraki ~2 ml ukjamaraki filtro centrífuga Amicon 100.000 MWCO ukjamaraki 1,5 CV IMAC ukjamaraki nayraqataru phuqantatarakiwa Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 tamaño columna de exclusión ukjamaraki, ukxaruxa elución ukjamaraki pachpa tampón ukjamaraki 1,5 CV ukjamaraki. Aka fracciones tamaño-exclusión uksa tuqita espectros de absorción uksa apthapiñawa ukatxa concentración de espectros de absorción ukaxa A880/A280 uksa tuqita 2,1 uksa tuqita ukhamaraki A880/A805 uksa tuqita 4,6 uksa tuqita 100 A880 uksa tuqita, ukaxa jank’akirakiw rejilla TEM congelada wakicht’añataki jan ukaxa -80°C uksanwa imaña wakisi.
Mä congelador de inmersión Leica EM GP ukampiwa lurataraki, ukhamata rejillas TEM de baja temperatura ukanaka wakicht’añataki. Aka complejo ukaxa diluido tampón IMAC ukjamaraki A880 de 50 ukjamaru, ukxaruxa 5μl ukjamaraki mä machaq descarga de resplandor QUANTIFOIL 1.2/1.3 malla de cobre revestida de carbono (Agar Scientific, Reino Unido) ukjamaru. Aka rejilla ukxa 20 °C ukjamaraki 60% humedad relativa ukjamaru 30 s ukjamaru incubada, ukxaruxa 3 s ukjamawa wañt’ayaña, ukxaruxa etano líquido ukjamaraki -176 °C ukjamaru ch’amanchaña.
Aka complejo RC-LH114-W uksankirinakaxa eBIC (Centro Electrónico de Bioimagen) (Fuente de Luz de Diamante Británico) uksanwa qillqt’ataraki microscopio Titan Krios ukampiwa, ukaxa irnaqaraki mä tensión acelerante 300kV, mä magnificación nominal 130.000× ukhamaraki mä energía de- Ajlliñawa mä brecha 20 eV. Mä Gatan 968 GIF Quantum ukampi detector de picos K2 ukampi luratarakiwa, ukhamata uñacht’awinaka qillqt’añataki modalidad de conteo ukanxa, ukhamata yatxatatanaka apthapiñataki. Aka pixel calibrado ukaxa 1,048Å ukjawa, ukatxa dosis ukaxa 3,83 e-Å-2s-1 ukjawa. Uka peliculajj 11 segundonakanwa apthapita ukat 40 cheqanakaruw jaljasïna. Microscopio ukar wasitat uñakipañatakix carbono ukamp ch’allt’at chiqampiw uñakipt’añama, ukatx sapa p’iyaruw kimsa películas apthapiñama. Taqpachanx 3130 películas ukanakaw apthapita, ukatx valores de desfoco ukax -1 ukatx -3μm ukjakamawa.
Aka complejo RC-LH116 uksa tuqita yatxatawixa apthapitawa pachpa microscopio ukampiwa Laboratorio de Bioestructura Asterbury (Universidad de Leeds, Reino Unido) uksana. Aka yatxatawixa apthapitawa modo de conteo ukjamaraki magnificación 130 k ukjamaraki pixel ukjamaraki calibrado ukjamaraki 1,065 Å ukjamaraki dosis 4,6 e-Å-2s-1. Uka peliculajj 12 segundonakanwa grabasïna ukat 48 tʼaqanakaruw jaljasïna. Taqpachanxa, 3359 películas ukjawa apthapita, ukatxa valores de desfoco ukaxa -1 ukhamaraki -3μm ukjakamawa.
Taqi yatxatawi lurawixa Relion 3.0 pipeline (42) ukanwa lurataraki. Aka Motioncorr 2 (43) ukjamaraki viga uksa tuqita chiqachañatakixa dosis uñakipañampi, ukxaruxa CTFFIND 4.1 (44) ukjamaraki parámetro CTF (función de transferencia de contraste) uksa tuqita yatxataña. Aka qallta etapas de procesamiento ukxaruxa fotomicrografías típicas ukanakaxa uñacht’ayatawa Figura 2. S16. Aka plantilla de selección automática ukaxa luratarakiwa amparampi ajlliwimpi niya 250 píxeles 1000 partículas ukanakampi mä marco 250 píxeles ukanxa ukhamaraki janiwa referencia de clasificación dos dimensiones (2D) ukanakaxa utjkiti, ukhamarusa janiwa uka clasificaciones ukanakaxa contaminación de muestra ukanakampi phuqhapkiti jani ukaxa jani características discernibles ukanakampiwa. Ukxarusti, taqi microfotografías uksanxa automático ajlliwiwa lurataraki, ukatxa RC-LH114-W ukaxa 849.359 partículas ukjawa, ukatxa complejo RC-LH116 ukaxa 476.547 partículas ukjawa. Taqi ajllitanakaxa pä muyu clasificación 2D no referencia ukampi luratarakiwa, ukatxa sapa t’ijtawi tukuyatatxa, partículas ukanakaxa área de carbono, contaminación de muestra, jani qhana uñacht’awinaka jani ukaxa ch’amampi ch’amanchata partículas ukanakaxa janiwa iyawsatäkiti, ukatxa 772.033 (90,9%) ukhamaraki 359.678 (75,5%) ) Partículas ukanakaxa 3D clasificación de RC-LH114-W ukatxa RC-LH116 ukanakampi. Qallta modelo de referencia 3D ukaxa luratarakiwa método de descenso de gradiente estocástico ukampiwa. Qallta modelo ukampi referencia ukhama apnaqasa, ajlliri partículas ukanakaxa pusi categorías ukarjamawa 3D ukanxa jaljataraki. Aka jamuqanxa modelo ukampixa mä referencia ukhamawa, refinación 3D ukampi lurañawa partículas ukanakaru jach’a categoría ukanxa, ukxaruxa qallta filtro de paso bajo 15Å ukampiwa apnaqaña, ukhamata 6 píxeles de bordes blandos ukanakampi yapxatañataki, ukatxa post-procesamiento de píxeles ukanakampiwa chiqapa lurañataki función de transferencia de Modulación de pico Gatan K2 del detector superior. Aka RC-LH114-W conjunto de datos ukatakixa, aka qallta modelo ukaxa mayjt’ayatarakiwa ch’amani densidad uksa tuqita apsutarakiwa mascara uksana (desconectada de la densidad compleja núcleo en Quimera UCSF). Uka apsutanakaxa (resoluciones de RC-LH114-W y RC-LH116 ukaxa 3,91 ukhamaraki 4,16 Å, ukjamaraki) ukaxa mä referencia ukhamawa payïri muyunta clasificación 3D ukataki. Uka partículas apnaqatanakax qallta clase 3D ukarux qutucht’atawa ukatx janiw barrio ukamp ch’aman correlación ukanipkiti. Uñstayaña jan ukaxa jani qhana estructural ukanaka utjatapa. Payïri muyu 3D uñakipaña tukuyatatxa, jilpacha resolución ukani jamuqaxa ajllitawa [RC-LH114-W ukatakixa mä jamuqaxa 377.703 partículas (44,5%), RC-LH116 ukatakixa pä categorías ukanakawa, taqpachaxa 260.752 partículas (54,7%) , Kawkhantixa pachpakixa qallta muytawi tukuyatatxa mä jisk’a mayjt’awimpi alineadas ukjakiwa]. Ajllit partículas ukanakax 400 píxeles ukan mä caja ukan wasitat apsutawa ukatx refinación 3D ukamp refinada. Aka disolvente mascara ukaxa luratarakiwa qallta filtro de paso bajo 15Å ukampi, 3 píxeles mapa expansión ukhamaraki 3 píxeles soft mask ukampi. Aka refinamiento CTF sapa partícula ukampi, corrección de movimiento por partícula ukampi ukhamaraki payïri muyu refinamiento CTF por partícula ukampi, refinamiento 3D, enmascarado de disolventes ukatxa post-procesamiento ukaxa sapa lurawi tukuyatatxa luratarakiwa, ukhamata juk’ampi suma qhananchañataki textura ukatxa. Aka FSC (Coeficiente de Correlación de Concha de Fourier) ukjamaraki 0,143 ukja khuchhurata uñakipata, ukatxa qhipa modelos RC-LH114-W ukhamaraki RC-LH116 ukjamaraki 2,65 ukhamaraki 2,80Å ukjawa. Curva FSC ukaxa qhipa modelo ukanxa uñacht ayatawa Figura 2. S17.
Taqi secuencias proteicas ukaxa UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5) uksatwa apsutaraki; LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4) ukjamaraki; RC-L (PufL; UniProt ID: O83005) ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi; RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7) ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi; RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9) ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi; Proteína-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3) ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. Aka SWISS-MODEL (45) ukjamaraki modelo de homología RC ukjamaraki secuencias proteicas RC-L, RC-M ukhamaraki RC-H ukjamaraki estructura cristalina Rba ukjamaraki. sphaeroides RC ukaxa mä plantilla ukhamawa (PDB ID: 5LSE) (46). Aka herramienta “mapa de ajuste” ukampi Quimera UCSF uksanxa modelo generado ukampi chikachasiñataki (47), estructura proteica uksa suma uñjañataki, ukhamaraki cofactor [4×BChl a (suti de residuos de biblioteca monómero = BCL), 2×BPh a (BPH), mä jan ukaxa pä kasta UQ10 (U10), mä hierro no heme (Fe) ukhamaraki mä 3,4-dihidrohexacarbonilcolina (QAK)] ukax Coot (48) ukampiw yapxatasi. Niyakixay QAK ukax biblioteca monómeros ukan jan utjkchixa, ukax parametrizado ukhamawa herramienta eLBOW ukampiwa PHENIX (49) ukanxa.
Ukxarusti, subunidad LH1 ukax luratarakiwa. Qalltanxa, herramienta automática de construcción PHENIX (49) uksanxa apnaqatarakiwa automáticamente lurañataki mä chiqa secuencia LH1 ukaxa mapa ukampi ukhamaraki secuencias proteicas LH1-α ukhamaraki LH1-β ukanakampi input ukhama. Subunidad LH1 juk’ampi phuqhata ajlliñawa, apsuña ukatxa Coot uksaru cargaña, amparampi secuencia faltante ukaru yapxataña, ukatxa amparampi taqpacha estructura uksa refinar janïra pä BCls a (BCL) ukhamaraki espirilloxantina (CRT) ukanakampi yapxatkasa [según los Rps relevantes La densidad del complejo LH1 y el contenido de carotenoides conocidos. Ukaxa (17)]. Subunidad LH1 phuqhata copiaña, ukatxa Quimera UCSF “Herramienta de Mapa de Acoplamiento” ukampi apnaqaña, ukaxa muelle ukarjamawa jak’a jan modelo ukana densidad LH1 ukanxa, ukatxa Coot ukanxa refinar; uka lurawixa mayampi luratarakiwa taqi subunidades LH1 ukanakaxa modelada ukhama. Aka RC-LH114-W uksa tuqita, Coot uksana densidad jan asignada uksa apsuñatakixa, proteína ukaxa segmentada ukatxa qhipa componentes no proteicos ukanakatxa mapa de Quimera USCF uksanxa ukhamaraki herramienta Autobuild ukaxa qallta modelo uñstayañatakixa apnaqatarakiwa, ukatxa qhipharuxa subunidades (proteína-W) Modelado. Ukax FENIX (49) ukanwa. Kuna secuencias faltantes ukaxa modelo resultado ukaru Coot (48) ukanxa yapxatatarakiwa, ukatxa manualmente refinar taqpacha subunidad. Jilt’iri jan asignada densidad ukaxa lípidos (ID biblioteca de monómeros PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL y POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) ukhamaraki moléculas UQ10 (U10) ukanakampi chikt’ata. Ukhamaraki, Coot (48) ukanxa PHENIX optimización (49) ukhamaraki manual optimización ukanakampiwa lurataraki, ukhamata modelo inicial completo ukaxa suma uñjañataki, ukhamata estadísticas de modelo ukatxa calidad visual de la ajuste ukaxa janiwa juk’ampi suma uñjatäkaspati. Tukuyañatakixa, LocScale (50) ukampiwa mapa local ukar ch’amanchaña, ukatxa walja yaqha ciclos ukanakawa lurasi, ukaxa densidad no asignada ukatxa optimización automática ukhamaraki manual ukanakampiwa lurataraki.
Aka péptidos, cofactores ukatxa yaqha lípidos ukhamaraki quinonas ukanakaxa atracados ukanakaxa densidades ukanakana uñacht’ayatawa Figuras 1 ukhamaraki 2. S18 a S23. Qhipa modelo ukan yatiyawipax estadística ukanx Tabla S1 ukan uñacht ayatawa.
Jani yaqha tuqita qhananchata, aka espectros de absorción UV/Vis/NIR ukaxa apthapitawa espectrofotómetro Cary60 (Agilent, EE.UU.) ukjamaraki 1 nm ukjamaraki 250 nm ukjamaraki 1000 nm ukjamaraki 0,1s ukja integración ukjamaraki.
Aka muestra ukjamaraki cubeta de cuarzo ukjamaraki 2 mm ukjamawa A880 ukjamaraki 1 ukjamaru, ukjamaraki espectro de absorción ukjamaraki 400 ukhamaraki 1000 nm ukjamaru apthapita. Aka espectros dicroicos circulares ukjamaraki espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Japón) ukjamaraki 1 nm ukjamaraki 400 nm ukjamaraki 950 nm ukjamaraki 20 nm min-1 ukjama escaneo ukjamaraki.
Aka coeficiente de extinción molar ukaxa yatxatatarakiwa dilución del complejo núcleo ukjamaraki A880 ukjamaraki niya 50. Aka 10μl ukjamaraki volúmenes ukjamaraki 990μl tampón de unión jan ukaxa metanol ukjamaraki, ukatxa jank’akirakiw espectro de absorción uksa apthapita, ukhamata BChl uksa jisk’achañataki. Aka BChl ukjamaraki sapa muestra de metanol ukjamaraki coeficiente de extinción ukjamaraki 771 nm ukjamaraki 54,8 mM-1 cm-1 ukjamaraki coeficiente de extinción ukjamaraki (51). Aka BChl uksa tuputa 32 (RC-LH114-W) jan ukaxa 36 (RC-LH116) ukjamaru jaljatarakiwa, ukhamata uñakipañatakixa concentración complejo núcleo uksa tuqita, ukxaruxa apnaqatarakiwa espectro de absorción uka pachpa muestra apthapita coeficiente de Extinción de tampón uksana. paralilu. Kimsa kuti tupunakawa sapa muestra uksa tuqita apsutaraki, ukatxa absorbancia promedio del máximo BChl Qy uksa tuqita jakhthapitarakiwa. Aka coeficiente de extinción RC-LH114-W ukjamaraki 878 nm ukjamaraki 3280±140 mM-1 cm-1 ukjamaraki coeficiente de extinción RC-LH116 ukjamaraki 880 nm ukjamaraki 3800±30 mM-1 cm-1 ukjamaraki.
UQ10 ukaxa (52) ukanxa uñakipatawa. Mä juk’a arumpixa, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) ukjamaraki sistema Agilent 1200 HPLC ukampiwa lurataraki. Aka 0,02 nmol de RC-LH116 jan ukaxa RC-LH114-W ukjamaraki 50μl de metanol:cloroformo 50:50 ukjamaraki cloruro férrico 0,02% (p/v) ukjamaraki inyectar aka preequilibrado Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm ukjamaraki 1 ml-1 min-1 ukjamaraki 40°C ukjamaraki HPLC ukjamaraki disolvente (80:20 metanol:2-propanol) ukjamaraki ×25 cm ukjamawa. Aka elución isocrática ukjamaraki disolvente HPLC ukjamaraki absorbancia uñakipañataki 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) ukhamaraki 780 nm (BChl) ukjamaraki 1 hora. Aka pico cromatograma 275 nm uksanxa 25,5 minutos uksanxa mayachatarakiwa, ukaxa janiwa yaqha compuestos detectables ukanakampixa uñakipatakiti. Aka área integrada ukaxa apsutarakiwa cantidad molar de UQ10 ukjamaraki referencia a la curva de calibración ukjamaraki inyección de estándares puros ukjamaraki 0 ​​a 5,8 nmol (Figure S14). Sapa muestra ukaxa kimsa kuti uñakipatawa, ukatxa yatiyata pantjasiwixa SD promedio ukampiwa chikachasiña.
Mä solución ukanxa complejo RC-LH1 ukaxa mä máxima absorción Qy 0,1 ukjamawa wakicht’ataraki 30 μM reducido citocromo de corazón de caballo c2 (Merck, Reino Unido) ukhamaraki 0 ​​a 50 μMUQ2 (Merck, Reino Unido). Kimsa muestras 1 ml ukjamaraki sapa concentración UQ2 ukjamaraki incubadas mä aruma ch’amakaru 4 °C ukjamaru ukhamata taqpacha adaptación ch’amakaru janïra tupuñataki. Aka solución ukaxa mä espectrofotómetro modular OLIS RSM1000 ukjamaraki 300 nm llama/500 línea rejilla, 1,24 mm entrada, 0,12 mm chika ukhamaraki 0,6 mm salida hendiduras ukanakampiwa apthapita. Mä filtro de paso 600 nm largo ukaw fototubo de muestra ukat tubo fotomultiplicador de referencia ukar mantañ chiqanx uchataraki, ukhamat excitación qhana jan utjañapataki. Aka absorbancia ukjamaraki 550 nm ukjamaraki integración ukjamaraki 0,15 s ukjamawa. Aka excitación qhanaxa 880 nm M880F2 LED (Diodo Emisor de Luz) (Thorlabs Ltd., Reino Unido) ukjamaraki cable de fibra óptica ukjamaraki 90% ukja ch’amampiwa mä controlador DC2200 (Thorlabs Ltd., Reino Unido) ukjamaraki qhana phunchhawi tuqiruxa mä ángulo 90° de. Viga medidora ukaxa espejo ukarux uñtatawa kuna qhanatix qalltanx muestra ukan jan ch’amt’atäki ukanak kutt’ayañataki. Uñakipaña absorbancia 10 s nayraqata qhananchawi 50 s. Ukxarusti, absorbancia ukaxa juk’ampi uñjatarakiwa 60 s ch’amakanxa, ukhamata yatxatañataki kunjamasa quinolol ukaxa espontáneamente jisk’acharaki citocromo c23 + (uñxatma Figura S8 ukaxa datos crudos ukataki).
Aka yatxatawixa luratarakiwa mä tasa inicial lineal 0,5 a 10 s ukjakama (concentración UQ2 ukarjama) ukhamaraki promedio de tasas kimsa muestras sapa concentración UQ2 uksana. Aka RC-LH1 concentración calculada por el coeficiente de extinción ukaxa apnaqatarakiwa aka tasa uksa tuqita eficiencia catalítica uksaru turkañataki, ukaxa gráfico ukhamawa Origin Pro 2019 (OriginLab, EE.UU.), ukatxa uñakipatarakiw modelo Michaelis-Menten ukampi ukhamata yatxatañataki aka valores aparentes Km ukhamaraki Kcat.
Aka medidas de absorción transitoria ukatakixa, muestra RC-LH1 ukaxa diluida ~2μM ukjamaraki tampón IMAC ukjamaraki 50 mM ascorbato de sodio (Merck, EE.UU.) ukhamaraki 0,4 mM Terbutina (Merck, EE.UU.) ukjamaraki. Ácido ascórbico ukaxa donante de electrones sacrificios ukjamawa, ukatxa tert-butaclofeno ukaxa inhibidor QB ukjamawa apnaqatarakiwa, ukhamata jach’a donante RC ukaxa jisk’achata (mä arunxa, janiwa fotooxidado) taqpacha medición lurawi taypina. Niya 3 ml de muestra ukxa apsutarakiwa mä célula giratoria personalizada (niya 0,1 m diámetro, 350 RPM) ukjamaraki 2 mm ukjamaraki óptico thakhi largo ukhamata muestra ukaxa láser thakinxa mä suma pachawa ch’amaka adaptación pulsos de excitación ukanaka taypina. Aka ~100-fs pulsos láser ukampi amplificar sistema láser Ti: Sapphire (Spectra Physics, EE.UU.) ukjamaraki muestra excitación 880 nm ukjamaraki mä tasa de repetición 1 kHz (20 nJ NIR jan ukaxa 100 nJ Vis). Janïra yatxatawi apthapiñkamaxa, muestra ukaxa excitación qhanampi niya 30 minutos ukjamawa uñacht’ayaña. Exposición ukax QA inactivación ukaruw puriyani (inas QA ukax mä kuti jan ukax pä kuti jisk’acharakchispa). Ukampis amuyapxañani aka lurawix reversible ukhamawa kunatix jaya pacha ch’amaka adaptación ukat qhipatxa, RC ukax juk’at juk’at QA actividad ukaruw kutt’ani. Mä espectrómetro Helios (Ultrafast Systems, EE.UU.) ukampiwa espectros transitorios ukanakaxa -10 a 7000 ps ukja qhipa pachampi uñakipata. Software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EE.UU.) ukampiw datos ukanakax jan qutucht’atäñapataki, ukatx mayacht’asiñapataki ukatx estandarización ukampiw lurasi. Aka software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) ukaxa apnaqatarakiwa conjunto de datos combinados ukampi espectros diferenciales ukanaka apsuñataki, ukaxa decadencia ukampi chikt’ata, jan ukaxa mä función ukampi apnaqaña, ukaxa walja exponentes ukanakaru convolver instrumento ukana jaysawipampi, ukhamata Origin (OriginLab, EE.UU.) ukanxa evolución espectral de una sola longitud de onda ukarjama.
Kunjamatixa nayraqata arsuwayktanxa (53), mä película fotosintética ukaxa complejo LH1 ukampi jani RC ukhamaraki periférica LH2 antena ukampi wakicht’atarakiwa. Aka membrana ukxa diluida 20 mM tris (pH 8,0) ukjamaraki mä cubeta de cuarzo ukjamaraki 2 mm ukjamaraki óptico thakhimpi. Aka pulso láser 30nJ ukjamaraki muestra ukjamaraki excitación ukjamaraki 540 nm ukjamaraki -10 ukjamaraki 7000 ps ukjamawa. Proceso de datos conjunto kunjamatixa qhananchaski ukhama Rps. pal uñacht’äwi.
Aka membrana ukxa pelletizado ukhamawa centrifugación 150.000 RCF 2 horas a 4 °C, ukxaruxa absorbancia 880 nm ukjamaraki resuspendida 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ukhamaraki 200 mM NaCl. Aka membrana ukxa juk’ata juk’ata 2% (p/v) β-DDM ukjamaru 1 hora ch’amakaru 4°C ukjamaru ch’allt’aña. Aka muestra ukaxa diluida 100 mM carbonato de trietilamonio (pH 8,0) (TEAB; Merck, Reino Unido) ukjamaraki mä concentración proteica 2,5 mg ml-1 (análisis Bio-Rad). Juk’ampi lurawixa luratarakiwa nayraqata uñt’ata lurawimpi (54), qalltatarakiwa dilución de 50 μg proteína ukjamaraki taqpacha 50 μl TEAB ukjamaraki 1% (p/v) laurato de sodio (Merck, Reino Unido). Ukxarusti sonicación 60 s, ukaxa jisk’achatarakiwa 5 mM tris (2-carboxietil) fosfina (Merck, Reino Unido) 37 °C 30 minutos. S-alquilación ukatakixa, muestra ukaxa incubada 10 mM metil S-metiltiometanosulfonato (Merck, Reino Unido) ukjamaraki 200 mM de solución de stock isopropanol ukjamaraki 10 minutos temperatura ambiente ukjamaraki. Aka digestión proteolítica ukxa luratarakiwa 2 μg tripsina/endoproteína Lys-C mezcla (Promega UK) ukjamaraki incubada 37 °C 3 horas. Aka tensioactivo laurato ukxa apsutarakiwa 50 μl acetato de etilo ukjamaraki 10 μl 10% (v/v) ácido trifluoroacético grado LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ukjamaraki vortex 60 s ukjamaru. Aka fase separación ukaxa ch’amanchatarakiwa centrifugación tuqi 15.700 RCF 5 minutos ukjamaru. Uka lurayirina protocoloparjamaxa, mä columna de espin C18 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ukampiwa suma aspiración ukhamaraki desaltar uka fase inferior ukaxa péptido ukampi. Ukxarusti wañt’ayatarakiwa centrifugación de vacío ukjamaraki, aka muestra ukxa 0,5% TFA ukjamaraki 3% acetonitrilo ukjamaraki 500 ng ukjamaraki cromatografía RP de nanoflujo ukjamaraki espectrometría de masas ukjamaraki parámetros del sistema ukjamaraki nayraqata uñakipata.
Aka MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ukjamaraki proteína identificación ukhamaraki cuantificación ukjamaraki Rps. palustris proteoma uksa tuqita yatxataña (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Aka proteómica de espectrometría de masas ukaxa Alianza ProteomeXchange uksanxa PRIDE socio repositorio tuqiwa (http://proteomecentral.proteomexchange.org) identificador de conjuntos de datos PXD020402 ukampiwa uñakipata.
Aka RPLC ukampiwa chikañchasi espectrometría de masas de ionización electrospray ukampiwa, aka complejo RC-LH1 ukaxa wakicht’atarakiwa Rps de tipo salvaje ukanakatxa. Aka nayraqata uñt’ata lurawimpi (16), aka concentración proteica ukjamaraki células palustris ukjamaraki 2 mg ml-1 ukjamaraki 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl ukjamaraki 0,03% (p/v) β- (análisis Bio-Rad) ) DDM ukjamaraki. Aka lurayirina protocolo ukarjamaxa, kit de purificación 2D (GE Healthcare, EE.UU.) ukampiwa 10 μg proteína ukjamaraki precipitación ukjamaraki precipitado ukjamaraki 20 μl 60% (v / v) ácido fórmico (FA), 20% (v / v) Acetonitrilo ukhamaraki 20% (v/v) umampi ch’amanchataraki. Aka phisqa microlitros ukjamaraki RPLC (Dionex RSLC) ukjamaraki espectrometría de masas (Maxis UHR-TOF, Bruker) ukjamaraki. Aka MabPac 1,2×100 mm columna (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ukjamaraki 60 °C ukjamaraki 100μlmin -1 ukjamaraki gradiente ukjamaraki 85% (v / v) disolvente A [0,1% (v / v) FA ukjamaraki 0,02% (V/v) solución acuosa TFA] ukjamaraki 85%(v/v) disolvente B ukjamaraki [0,1%(v/v) FA ukhamaraki 0,02%(v/v) 90%(v/v) acetonitrilo TFA] Fuente estándar de ionización electrospray ukampi parámetros predeterminados ukampi 60 minutos ukjata jila, espectrómetro de masas ukaxa 100 a 2750 m/z (ratio masa a carga) ukjamawa. Portal de recursos bioinformáticas ExPASy FindPept herramienta (https://web.expasy.org/findpept/) ukan yanapt’apampixa, espectro de masas ukaxa subunidades del complejo ukanakaru mapa.
Aka celulanakaxa 72 horas ukjamawa 100 ml NF-bajo (10μMm-2 s-1), medio (30μMm-2 s-1) jan ukaxa alto (300μMm-2 s-1) qhanampi jiltatarakiwa. Medio M22 (medio M22 ukanxa sulfato de amonio ukaxa apsutarakiwa ukatxa succinato de sodio ukaxa acetato de sodio ukampiwa turkataraki) mä botella 100 ml de tornillo-top (23). Pä ciclos 30-s uksanxa, 0,1 micras de vidrio perlas ukanakaxa perlas ukanakampiwa lurataraki mä relación de volumen 1:1 ukjamaraki lisis de células ukjamaraki hielo ukjamaraki 5 minutos ukjamawa chilltataraki. Aka materia insoluble, células janïra p’akjata ukhamaraki perlas de vidrio ukanakaxa apsutarakiwa centrifugación 16.000 RCF 10 minutos microcentrífuga de banco ukanxa. Aka membrana ukjamaraki 100.000 RCF ukjamaraki 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ukjamaraki 40/15% (p/p) gradiente de sacarosa ukjamaraki 10 horas ukjamaraki.
Kunjamatixa nayra lurawinakasaxa qhananchata, inmunodetección de la etiqueta His en PufW (16). Mä juk’a arumpixa, complejo núcleo purificado (11,8 nM) jan ukaxa membrana ukaxa pachpa concentración de RC (determinada por oxidación ukjamaraki espectro de diferencia reducido ukjamaraki carga ukampiwa chikachasiña aka gel tintado) ukjamaraki 2x tampón de carga SDS (Merck, Reino Unido) ukjamaraki pä kuti diluida. Aka proteínas ukaxa jaljatarakiwa mä réplica 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido). Mä gel ukaxa Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Reino Unido) ukampiwa ch’amanchataraki, ukhamata carga ukhamaraki uñjañataki subunidad RC-L. Aka proteína ukaxa payïri gel uksanxa apsutarakiwa membrana de flúor de polivinilideno activado por metanol (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ukjamaraki inmunoensayo ukjamaraki. Aka membrana PVDF ukxa bloqueada 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 ukhamaraki 5% (p / v) leche desnatada ukjamaraki, ukxaruxa incubada ukhamaraki anticuerpo primario anti-His (en Diluir el tampón de anticuerpos [50 mM tris-HCl (pH 7,6), ukjamaraki, akaxa incubada. 150 mM NaCl ukjamaraki 0,05% (v/v) Tween-20] ukjamaraki 1:1000 A190-114A, Laboratorios de Bethyl, EE.UU.) ukjamaraki 4 horas ukjamaraki. Ukxarusti 3 kuti 5 minutos ukjamawa tampón de anticuerpos ukjamaraki, membrana ukxa mayachatarakiwa peroxidasa de rábano (Sigma-Aldrich, Reino Unido) anticuerpo secundario anti-rata (diluido 1:10.000 en tampón de anticuerpos) Incubada ukhamata detección (5 minutos ukjata 3 jariña tampón anticuerpos ukjamaraki) sustrato de quimiluminescencia WESTAR ETA C 2.0 ukampiwa (Cyanagen, Italia) ukat Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido) ukanakampi.
Sapa gel tintado jan ukaxa carril de inmunoensayo ukanakana distribución de intensidad ukanaka dibujaña, área pico ukana mayachaña ukhamaraki calcular la relación de intensidad de RC-L (gel tintado) ukhamaraki Proteína-W (inmunoensayo), ImageJ (57) ukanxa Proceso de la imagen. Aka ratios ukaxa mayjt’ayatarakiwa ratios molares ukjamaraki amuyasa aka ratio RC-L ukatxa proteína-W ukjamaraki purapa muestra RC-LH114-W uksanxa 1:1 ukjamaraki normalización taqpacha conjunto de datos ukjamaraki.
Aka qillqatan materiales suplementarios ukanakatakix http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ukar mantasma
Akax mä jist’arat qillqatawa, ukax Licencia de Atribución Creative Commons ukan kamachinakaparjamaw jaljata. Uka qillqatax jan jark’at apnaqañ, jaljañ ukat kunayman medios ukan uñstayañ jaytawayi, ukax nayrïr lurawix sum uñt’ayatäñapawa.
Qhanacht’awi: Correo electrónico ukar uñt’ayañakiw mayipxsma, ukhamat khititix página ukar iwxt’kta ukax yatiñapataki, jupanakax correo electrónico ukar uñjañ munapxta ukat janiw spam ukhamäkiti. Jiwasax janiw kuna correo electrónico ukanakas katjañäniti.
Aka jiskt’awix mä visitante ukhamätati janicha uk yant’añatakiw apnaqasi ukat automático spam ukar jan uñt’ayañatakiw apnaqasi.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martín, David A. Yapuchirinaka, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Aka jach’a resolución ukanxa complejo trampa 1 de luz ukaxa centro de reacción uksanxa machaq amuyunaka churaraki dinámica de quinona uksa tuqita.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martín, David A. Yapuchirinaka, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Aka jach’a resolución ukanxa complejo trampa 1 de luz ukaxa centro de reacción uksanxa machaq amuyunaka churaraki dinámica de quinona uksa tuqita.
©2021 Asociación Americana para el Adelanto de Ciencia uka tuqita. taqi derechos ukanakaxa jark’atawa. AAAS ukax HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ukat COUNTER ukanakan yanapiripawa. CienciaAvances ukax ISSN 2375-2548 ukaruw uñt’ayasi.