Jichha pacha *Jichha pacha: Colonia 50931, Alemania, Colonia Excelencia Cluster Investigación sobre Respuesta del Estrés Celular en Enfermedades relacionadas con el Envejecimiento (CECAD).
Mitocondrial usunakan neurodegeneración ukax jan kutt’ayañjamaw uñjasi kunatix plasticidad metabólica neuronas ukax mä juk’akiwa, ukampis disfunción mitocondrial ukax autonomía celular metabolismo neuronal cuerpon jan walt’awiparux janiw sum amuyatäkiti. Aka tuqinxa, uñt’ayapxaraktwa proteoma específico celular de neuronas Purkinje ukampi progresiva deficiencia OXPHOS ukampi kunatixa dinámica de fusión mitocondrial jan walt’ayata. Jiwasax jikxatawayktanwa, disfunción mitocondrial ukax mä jach’a mayjt’awiw proteómica tuqinx utjawayi, qhipharux activación secuencial de programas metabólicos precisos ukaruw puriyi janïr células jiwatapatxa. Jani suyt’ata, uñakipapxaraktwa qhana inducción de piruvato carboxilasa (PCx) ukhamaraki yaqha peroxidasas ukanakampi chikachasiñataki aka intermedios de ciclo TCA ukanakampi. PCx jark’aqawix estrés oxidativo ukat neurodegeneración ukanakaruw juk’amp ch’amanchawayi, ukax uñacht’ayiwa aterosclerosis ukax mä jark’aqasiñ efectow neuronas ukanakan jan OXPHOS ukan utjatapata. Fusión mitocondrial ukar kutt’ayañax neuronas terminalmente degeneradas ukanx uka características metabólicas ukanakaruw taqpach mayjt’ayi, ukhamat células jiwatat jark’aqasi. Jiwasan yatxatawinakax nayrax jan uñt’at thakhinak uñt’ayi, ukax disfunción mitocondrial ukarux resistencia uñacht’ayi ukatx neurodegeneración ukax qhipa pachanakanx mayjt’ayatarakispawa sasaw uñacht’ayi.
Mitocondrias ukaxa metabolismo energético neuronal ukaru mantañatakixa wali ch’amanchatawa, ukaxa jach’a sintoma neurológico ukanakampiwa jaqina mitocondriales usunakampi chikt’ata. Jilapacha aka usunakaxa mutaciones génicas ukanakampiwa lurataraki, ukaxa regula la expresión génica mitocondrial (1, 2) jan ukaxa destrucción génica ukanakampi chikañchata dinámica mitocondrial ukampiwa, ukaxa indirectamente afectan la estabilidad del ADN mitocondrial (ADNm) (3, 4). Uywa modelos ukanakan irnaqawipax uñacht’ayiwa, disfunción mitocondrial ukar jaysañatakix muyuntat tejidos ukanx, vías metabólicas conservadoras (5-7) ukanakax activadas ukhamawa, ukhamatwa wali wakiskir amuyunakax patogénesis uka complejas usunakat churaraki. Ukasti wali mayjawa, jiwasana amuyawisaxa mayjt’awinaka metabólicas de tipos específicos de células ukanakaxa utjiwa kunatixa fracaso general de la producción de adenosina trifosfato mitocondrial cerebral (ATP) ukaxa fundamental ukhamawa (8), ukaxa qhananchawa wakisiwa uñt’añataki metas terapéuticas ukaxa apnaqasispawa usunaka jark’aqañataki jan ukaxa jark’aqañataki. Neurodegeneración ukat jark’aqasiñataki (9). Uka jan yatiyawixa akawa kunatixa células nerviosas ukaxa wali amuyatawa wali jisk’a flexibilidad metabólica ukampi chikachasiñataki aka tipos celulares de tejidos muyuntki ukanakampi (10). Uñakipt’ataxa aka celulanakaxa mä jach’a lurawiwa coordinación de suministro de metabolitos a neuronas ukhamata ch’amanchañataki transmisión sináptica ukhamaraki jaysañataki usuchjatanakaru ukhamaraki usunakaru, ukhamaraki capacidad de adaptar metabolismo celular ukaxa ch’amamp condiciones de tejido cerebral ukarux niyas células gliales ukanakarukiwa (11-14). Ukhamaraki, heterogeneidad celular inherente de tejido cerebral ukaxa jilpachxa jark’iwa yatxatawi mayjt’awinaka metabólicas ukatxa subgrupos neuronales específicos ukanakana. Ukhamatwa, neuronas ukan disfunción mitocondrial ukan chiqap consecuencias celulares ukat metabólicas ukanakat juk’akiw yatisi.
Uka consecuencias metabólicas ukanaka amuyañatakixa, neuronas Purkinje (PNs) ukanakaxa kunaymana etapas de neurodegeneración ukanakanwa, ukaxa fusión de membrana exterior mitocondrial (Mfn2) uksa t’unjañataki. Ukhamaraki, jaqina mutaciones Mfn2 ukaxa mä forma de neuropatía sensorial motora hereditaria uñt’atawa Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), ukaxa condicional destrucción de Mfn2 ch’uqitxa mä suma uñt’ata inducción de oxidación Fosforilación (OXPHOS) disfunción método. Kunayman subtipos neuronales (16-19) ukatxa ukatxa fenotipo neurodegenerativo ukaxa sintoma neurológico progresivo ukanakampi chikt’atawa, kunjamatixa trastornos de movimiento (18, 19) jan ukaxa ataxia cerebelosa (16). Mä combinación de proteómica cuantitativa (LFQ) libre de etiquetas, metabolómica, imagen, ukhamaraki métodos virológicos ukanakampi, uñacht’ayapxaraktwa neurodegeneración progresiva ukaxa wali ch’amampiwa induce piruvato carboxilasa (PCx) ukhamaraki yaqha factores ukanakaxa arteriosclerosis de PNs in vivo La expresión de enzimas. Aka yatxatawi chiqapa uñakipañatakixa, específicamente regulación de la expresión de PCx en PNs deficientes de Mfn2, ukatxa jikxatapxaraktwa aka operación ukaxa agrava el estrés oxidativo ukhamaraki acelera la neurodegeneración, ukhamarusa uñacht’ayatarakiwa azoospermia ukaxa confere la muerte celular Adapabilidad metabólica. Sinti expresión de MFN2 ukaxa taqpacha qhispiyaspawa degeneración terminal PN ukampi sinti deficiencia OXPHOS ukampi, jach’a manq’aña ADN mitocondrial ukampi, ukhamaraki amuyataxa p’akintata red mitocondrial ukampi, ukaxa juk’ampi ch’amancharaki aka forma de neurodegeneración ukaxa juk’ampi kutt’ayaspawa etapa avanzada de enfermedad ukatxa janïra células jiwatapana.
Ukhamarusa, mitocondrias ukanaka uñjañatakixa Mfn2 knockout PNs uksanxa, mä cepa de rata ukampiwa lurataraki, ukaxa mitocondrias dependientes de Cre uksaruwa ch’amancharaki, ukaxa proteína fluorescente q’illu (YFP) (mtYFP) (20) Cre expresión uksaruwa uñakipataraki ukatxa uñakipapxaraktwa morfología mitocondrial in vivo. Jiwasax jikxatawayktanwa, PNs ukanx gen Mfn2 ukan t’unjatapax red mitocondrial ukan juk’at juk’at jaljañapatakiw puriyaspa (Figure S1A), ukatx nayrïr mayjt’awix 3 semanas de edad ukan jikxatasiwayi. Uka kipkaraki, jach’a degeneración capa celular PN, kunjamatixa uñacht’ayata inmunotinción Calbindina chhaqhata, janiwa qalltawaykiti 12 semanas ukjakama (Figure 1, A y B). Nayra mayjt’awinakax morfología mitocondrial ukat uñjkañ qalltawi neuronal ukanakan pacha jan walt’awipax metabólicos mayjt’awinak yatxatañatakiw ch’amanchawayi, ukax disfunción mitocondrial ukan janïr celula jiwatapat uñstayatawa. Jiwasaxa lurapxtanwa mä estrategia de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) ukampi YFP (YFP+)-expresador PN (Figure 1C), ukhamaraki control de ratas (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), aka qhiparuxa CTRL sata (Figure S1B). Aka optimización de la estrategia de gating basada en la intensidad relativa de la señal YFP ukaxa permite purificar cuerpo YFP+ (YFPhigh) de PNs de no PNs (YFPneg) (Figure S1B) jan ukaxa putativo fragmentos axónico/dendríticos fluorescentes (YFPlow; Figura S1D, izquierda), chiqapa microscopio confocal (Figure S1D, derecha). Uka identidad de la población clasificada ukanaka chiqapa uñjañatakixa, proteómica LFQ ukjamaraki análisis de componentes principales uksa lurapxaraktwa, ukatxa jikxatapxaraktwa qhana t’aqanuqtawi células YFPhigh ukhamaraki YFPneg ukanaka taypina (Figure S1C). YFPhigh celulas uñacht’ayiwa mä enriquecimiento neto uñt’ata PNs marcadores (mä arunxa Calb1, Pcp2, Grid2 ukatxa Itpr3) (21, 22), ukampisa janiwa enriquecimiento proteínas comúnmente expresadas neuronas jan ukaxa yaqha tipos celulares (Figure 1D) ). Mä chiqanchawi muestras ukanakampi clasificadas YFPhigh celulas apthapita independientes experimentos ukanxa uñacht’ayiwa mä coeficiente de correlación> 0,9, uñacht’ayiwa suma reproducibilidad replicados biológicos ukanaka taypina (Figure S1E). Mä juk’a arumpixa, aka yatxatawinakax jiwasan plan de aislamiento agudo y específico de PN factible ukatakix valida. Kunatixa sistema conductor L7-cre apnaqataxa induce recombinación mosaico ukaxa nayrïri semana de parto ukjata (23), qalltawaytanwa culling ch’uqi CTRL ukatxa condicional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Neuronas apthapiña. Recombinación tukuyatatxa, ukaxa Mfn2cKO satawa 4 semanas ukjata. Kunjamatixa tukuyañatakixa, 8 semanas ukjawa ajlliwaytanxa kunapachatixa capa PN ukaxa wali ch’amanchata ukhama qhana fragmentos mitocondriales ukanakampi (Figure 1B y Figura S1A). Taqi tuqitxa, taqpacha 3013 proteínas ukjawa jakhthapita, ukatxa niya 22% ukjawa anotaciones MitoCarta 2.0 ukjamaraki proteoma mitocondrial ukjamaraki mitocondrias ukjamaraki (Figure 1E) (Figure 1E) (24). Aka análisis de expresión génica diferencial lurata 8 semananxa uñacht’ayiwa 10,5% ukja taqpacha proteínas ukanakaxa wali mayjt’atawa (Figure 1F y Figura S1F), ukatxa 195 proteínas ukanakaxa reguladas abajo ukhamaraki 120 proteínas ukanakaxa reguladas ascendentes (Figure 1F). Ukhamaraki, aka “análisis de vías innovadoras” ukaxa uñacht’ayiwa aka diferencialmente expresados ​​ukaxa jilpachaxa mä conjunto restringido de vías metabólicas específicas ukanakaru (Figure 1G). Ukasti, OXPHOS ukhamaraki señalización de calcio ukanakampi chikt’ata thakhinakaxa down-regulación ukaxa chiqapawa inducción de disfunción mitocondrial PNs deficientes de fusión ukanakana, yaqha categorías ukanakaxa jilpachaxa metabolismo aminoácidos ukanakampiwa uñakipata, ukaxa wali jach’a regulado ukhamawa, ukaxa metabolismo ukampixa chikakiwa, ukaxa PNs mitocondrial ukanakampiwa. Recableado ukax mäkiw lurasi. jan walt’awinaka.
(A) Fotografías confocales representativas de secciones cerebelosas de ratas CTRL y Mfn2cKO uñacht’ayiwa progresiva pérdida de PNs (calbindina, gris); núcleos ukaxa contratintadas ukhamaraki DAPI. (B) Cuantificación de (A) (análisis de variancia de una vía, ***P<0,001; n = 4 a 6 círculos kimsa ch’uqitxa). (C) Yant’awi luraña thakhi. (D) Mapa calorífico uksa tuqita qhananchawi markachirinaka específicos Purkinje (pata) ukhamaraki yaqha kasta celulanaka (chika taypina). (E) Diagrama de Venn uñacht’ayiwa qhawqha proteínas mitocondriales ukanaka uñt’ata PN clasificada ukanxa. (F) Gráfico volcánico de proteínas diferencialmente expresadas neuronas Mfn2cKO uksana 8 semanas ukjakama (valor de corte de significación 1,3). (G) Aka creatividad thakhi uñakipañaxa uñacht’ayiwa phisqa wali wakiskiri up-regulation (wila) ukhamaraki down-regulation (azul) thakhinaka Mfn2cKO PN ukanxa 8 semanas ukjama uñt’atawa. Nivel promedio de expresión sapa proteína detectada ukaxa uñacht’ayatawa. Mapa de calor escala grises: P valor uñakipata. ns, janiw wakiskirïkiti.
Aka proteómica uksa tuqita yatxatawixa uñacht’ayiwa expresión proteica complejos I, III, IV uksanakanxa juk’ata juk’ata jisk’achata. Complejos I, III ukatxa IV ukanakaxa taqpachawa subunidades esenciales codificadas ADNmt ukanakampi, ukatxa complejo II, ukaxa codificados nucleares ukampikiwa, ukaxa básicamente janiwa afectatakiti (Figure 2A y Figura S2A). . Aka proteómica lurawimpi chika, inmunohistoquímica de secciones de tejido cerebelosa ukaxa uñacht’ayiwa MTCO1 (subunidad 1 de oxidasa de citocromo C mitocondrial) nivel de subunidad complejo IV PN uksanxa juk’ata juk’ata jisk’achasiwa (Figure 2B). Aka subunidad codificada ADNmt ukampi Mtatp8 ukaxa wali jisk’achatarakiwa (Figure S2A), ukatxa nivel de estado estable ukaxa subunidad de sintasa ATP codificada nuclear ukampixa janiwa mayjt’ayatakiti, ukaxa chiqapawa uñt’ata complejo F1 submontaje estable ATP sintasa ukampi kunapachatixa expresión de ADNmt ukaxa estable ukhama. Uka formación ukax mäkiw utji. Interrupción (7) ukat juk’ampinaka. Aka nivel de ADNmt uñakipata aka PNs Mfn2cKO clasificados ukanxa reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR) ukampixa chiqapawa juk’ata juk’ata jisk’achata ADNmt copia jakhuwimpi. Grupo control ukampi chikachasiñatakixa, 8 semanas de edad uksanxa, niya 20% ukjakiwa nivel de ADNmt ukjamaraki Was retenido (Figure 2C). Aka lurawimpi chika, tinción microscopía confocal Mfn2cKO PNs ukjamaraki ADN uñakipañatakixa uñacht’ayiwa pacha tuqita manq’aña nucleótidos mitocondriales (Figure 2D). Jiwasaxa jikxatawayktanwa yaqhipa candidatos ukanakakiw degradación proteica mitocondrial ukatxa respuesta de estrés uksanxa up-regulados ukhama, Lonp1, Afg3l2 ukatxa Clpx, ukhamaraki factores de montaje complejos OXPHOS. Janiwa mä jach’a mayjt’awixa uñjasiwaykiti niveles de proteínas ukanxa apoptosis uksanxa (Figure S2B). Ukhamaraki, jikxatawayapxaraktwa mitocondrias ukatxa canales de retículo endoplásmico ukanakaxa transporte de calcio uksanxa jisk’a mayjt’awinakakiwa (Figure S2C). Ukhamaraki, aka chiqanchawixa aka proteínas autofagias ukanakampi chikachasiñatakixa janiwa mä jach’a mayjt’awinakaxa utjkiti, ukaxa chiqapawa uñjata inducción de autofagosomas uñakipata in vivo ukanxa inmunohistoquímica ukhamaraki microscopía electrónica ukanakampi (Figure S3). Ukampirusa, disfunción progresiva OXPHOS ukaxa PNs uksanxa qhana mayjt’awinaka mitocondriales ultraestructurales ukanakampi chikt’atawa. Aka clústeres mitocondriales ukanakaxa uñjasirakispawa cuerpos celulares ukhamaraki árboles dendríticos de Mfn2cKO PNs 5 ukhamaraki 8 semanas ukanakana, ukatxa estructura de membrana interna ukaxa wali jach’a mayjt’awinakawa (Figure S4, A y B). Aka mayjt’awinaka ultraestructural ukhamaraki mä jach’a jisk’achawi ADNmt ukampi chika, análisis de rebanadas agudas cerebelosas cerebrales con éster metil tetrametilrodamina (TMRM) uñacht’ayiwa potencial de membrana mitocondrial Mfn2cKO PNs uksanxa wali jisk’achatawa (Figure S4C).
(A) Análisis de curso de tiempo ukaxa nivel de expresión del complejo OXPHOS uka tuqita. Aka proteínas P<0,05 ukampi 8 semanas ukjakamawa uñjasiraki (ANOVA de dos vías). Línea punteada: Janiw CTRL ukar uñtasitx chiqañchatäkiti. (B) Ch’iqa: Mä uñacht’awi sección cerebelosa ukanxa anticuerpo anti-MTCO1 ukampiwa etiquetado (barra de escala, 20 μm). Purkinje células cuerpos ukanakan utjki uka chiqax q’illu ch’uxñanakampi ch’allt’atawa. Kupi: Cuantificación de niveles de MTCO1 (análisis de variancia de una vía; n = 7 a 20 células analizadas de tres ratas). (C) Análisis qPCR de número de copia de ADNmt en el PN ordenado (análisis de variancia de una vía; n = 3 a 7 ratas). (D) Ch’iqa: Mä uñacht’awi mä rebanada cerebelosa ukanxa anticuerpo anti-ADN ukampiwa etiquetado (barra de escala, 20 μm). Purkinje células cuerpos ukanakan utjki uka chiqax q’illu ch’uxñanakampi ch’allt’atawa. Kupi: Cuantificación de lesiones de ADNmt (análisis de variancia de una vía; n = 5 a 9 células kimsa ch’uqitxa). (E) Mä uñacht’awi sección cerebelosa aguda ukanxa uñacht’ayatawa células mitoYFP + Purkinje (flecha) mä grabación de abrazadera de parche entera célula ukanxa. (F) Curva IV ukana jakhthapiwipa. (G) Grabaciones representativas de inyección de corriente despolarizante ukanakaxa CTRL ukhamaraki Mfn2cKO Purkinje celulas ukanakana. Pata rastro: Nayrïr pulso ukax AP ukar ch’amanchawayi. Ukax akham sañ muniwa: Frecuencia AP máxima. (H) Cuantificación de insumos espontáneos postsinápticos (sPSPs) ukanaka. Rastro de grabación representativa ukatxa ratio de zoom ukaxa (I) ukanwa uñacht ayata. Mä thakhi uñakipaña variancia uñakipata n = 5 a 20 celulas kimsa ch’uqitxa. Uka yatxatawixa promedio±SEM ukjamawa; *P<0,05 ukat juk’ampinaka; **P<0,01 ukatsti; ***P<0,001 ukhawa. (J) Rastros representativos de AP espontáneo grabadas ukaxa modo de abrazadera de parche perforada ukampiwa lurataraki. Pata rastro: Máxima frecuencia AP ukaxa. Inferior rastro: mä sapa AP ukan zoom. (K) (J) ukarjamaxa frecuencia AP promedio ukhamaraki máxima ukanaka jakhthapiña. Mann-Whitney sat chachan yantʼäwipa; n = 5 celulas ukjamaraki pusi ch’uqitxa uñakipatawa. Uka yatxatawixa promedio±SEM ukjamawa; janiw wakiskirïkiti.
Qhana OXPHOS jan walt’awixa 8 semanas Mfn2cKO PN ukanxa uñjasiwa, ukaxa uñacht’ayiwa función fisiológica de neuronas ukaxa sinti jan waliwa. Ukhamarusa, uñakipapxaraktwa características eléctricas pasivas de las neuronas deficientes OXPHOS 4 a 5 semanas ukhamaraki 7 a 8 semanas ukjamaraki grabaciones de abrazadera de parche de células enteras ukanakampi rebanadas agudas cerebelosas ukanakana (Figure 2E). Jani suyt’ata, potencial promedio de membrana de descanso ukhamaraki resistencia de entrada de neuronas Mfn2cKO ukaxa control ukampi kikiparakiwa, ukampirusa sutil mayjt’awinakaxa utjarakiwa células ukanaka taypina (Tabla 1). Ukhamaraki, 4 ukatxa 5 semanas ukjakamaxa, janiwa mä jach’a mayjt’awixa jikxataskiti relación corriente-tensión (curva IV) uksanxa (Figure 2F). Ukampirusa, janiwa mä neuronas Mfn2cKO 7 ukatxa 8 semanas ukjaxa régimen IV (paso de hiperpolarización) uksatxa qhispiwaykiti, ukaxa uñacht’ayiwa qhana sensibilidad ukaxa utjiwa potencial de hiperpolarización ukatxa aka qhipa pachana. Uka kipkaraki, neuronas Mfn2cKO uksanxa, corrientes despolarizante ukaxa descargas potenciales de acción repetitiva (AP) uksaruwa puriyi, ukaxa suma tolerada ukhamawa, ukaxa uñacht’ayiwa taqpacha descarga ukanakaxa janiwa sinti mayjakiti 8 semanas de neuronas control ukanakatxa (Tabla 1 y Figura 2G). Ukhamaraki, frecuencia ukhamaraki amplitud de corrientes postsinápticas espontáneas (sPSCs) ukaxa chiqapawa aka grupo control ukampi, ukatxa frecuencia de eventos ukaxa jilxatarakiwa 4 semanas ukatxa 5 semanas ukatxa 7 semanas ukatxa 8 semanas ukampi mä kipka jilxatawimpi (Figure 2, H y I). Uka pachaxa sináptica maduración ukaxa PNs (25). Ukhamaraki, perforados PNs parches ukxaruxa apsutarakiwa. Aka configuración ukaxa jark’iwa compensación posible de defectos celulares ATP, kunjamatixa lurasispa grabación de abrazadera de parche de células enteras ukanxa. Jisk’a tuqitxa, potencial de membrana de descanso ukatxa frecuencia de disparo espontáneo de neuronas Mfn2cKO ukaxa janiwa afectatakiti (Figure 2, J y K). Mä juk’a arumpixa, aka yatxatawixa uñacht’ayiwa PNs ukanakaxa qhana disfunción OXPHOS ukampixa suma atipjapxaspawa patrones de descarga de alta frecuencia ukanakampi, ukaxa uñacht’ayiwa kunatixa utjiwa mä mecanismo de compensación ukaxa permite mantener respuestas electrofisiológicas cercana normales.
Uka yatxatawixa promedio ± SEM ukjamawa uñacht ayata (análisis de variancia de una vía, prueba de comparación múltiple de Holm-Sidak; *P<0,05). Unidad jakhuxa paréntesis ukanakampiwa uñacht’ayata.
Jiwasaxa yatxatañatakiw sartasipxta, kuna categorías ukanakas conjunto de datos proteómicos (Figure 1G) ukanx thakhinakax utji, ukax OXPHOS sinti jan walt’awiruw saykataspa, ukhamat qhanañchañataki kunats PN afectado ukax electrofisiología niya normal ukar mantenispa (Figure 2, E a K). . Análisis proteómico ukaxa uñacht’ayiwa aka enzimas ukanakaxa catabolismo de aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) uksanxa wali suma reguladas ukhamawa (Figure 3A y Figura S5A), ukatxa qhipa producto acetil-CoA (CoA) jan ukaxa succinil CoA ukaxa tricarboxilatos ukanakaruxa yapxataspawa ciclo de Ácido de arteriosclerosis (TCA) uksanxa. Jiwasaxa jikxatawayktanwa, BCAA transaminasa 1 (BCAT1) ukatxa BCAT2 ukaxa panpachawa jilxattawayi. Jupanakaxa catalizaron nayrïri lurawi catabolismo BCAA ukjamaraki glutamato ukjamaraki α-cetoglutarato ukjamaraki (26). Taqi subunidades ukanakaxa lurapxi complejo deshidrogenasa de cetoácido de cadena ramificada (BCKD) ukaxa ascendente regulados (complejo ukaxa cataliza la decarboxilación posterior ukhamaraki irreversible del esqueleto de carbono BCAA ukatxa) (Figure 3A y Figura S5A). Ukampirusa, janiwa qhanpach mayjt’awinakaxa BCAA uksanxa jikxataskiti aka PN ordenado uksanxa, ukaxa inasa jilxatata celula uksa tuqita aka aminoácidos esenciales uksa tuqita jan ukaxa yaqha fuentes (glucosa jan ukaxa ácido láctico) apnaqaña tuqita ciclo TCA uksa tuqita yapxatañataki (Figure S5B). Ukhamaraki, PNs jan OXPHOS ukampixa uñacht’ayatarakiwa jilxatata descomposición de glutamina ukhamaraki actividades transaminación 8 semanas de edad ukanxa, ukaxa uñacht’ayatarakispawa regulación ascendente de las enzimas mitocondriales glutaminasa (GLS) ukhamaraki glutamina piruvato transaminasa 2 (GPT2) ukanakampi (Figure 3, A y C). Ukhamaraki, GLS uksa tuqita regulación ascendente ukaxa isoforma glutaminasa C (GLS-GAC) uksa tuqiruxa (Mfn2cKO/CTRL uksa tuqita mayjt’awixa niya 4,5 ukjawa, P = 0,05), ukatxa específica up-regulación ukaxa tejidos cánceres uksanxa Bioenergía mitocondrial uksa tuqiruxa yanapt’arakispawa. (27) ukat juk’ampinaka.
(A) Mapa de calor ukaxa uñacht’ayiwa pliegue mayjt’awi nivel proteico ukaxa especificado ruta ukatakixa 8 semanas ukjakama. (B) Uñacht’awi mä rebanada cerebelosa uñakipata anticuerpo anti-PCx (barra de escala, 20 μm). Q’illu flechax Purkinje celula cuerporuw uñacht’ayi. (C) Análisis de expresión proteica de curso de tiempo identificado como candidato importante para la aterosclerosis (prueba t múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 ratas). (D) Aka pata tuqina: Mä diagrama esquemático uñacht’ayiwa kunaymana thakhinaka mantañataki carbono etiquetado ukaru mantañataki aka [1-13C]piruvato trazador uksana (mä arunxa, PDH tuqi jan ukaxa ruta trans-arterial tuqi). Uraqina: Aka violín uñacht’awixa uñacht’ayiwa sapa patakata carbono único etiquetado (M1) ukjamaraki ácido aspartico, ácido cítrico ukhamaraki ácido málico ukjamaraki etiquetado ukjamaraki rebanadas agudas cerebelosas ukjamaraki [1-13C]piruvato (prueba t pareada; ** P <0,01). (E) Uñacht’ayata thakhi tuqita pacha saräwi uñakipaña. Ukhamaraki, proteínas ukaxa P<0,05 ukampi 8 semanas ukjaruwa uñjasi. Línea discontinua: janiwa chiqapa chiqanchawixa utjkiti (análisis de variancia de dos vías; * P <0,05; *** P <0,001). Uka yatxatawixa promedio±SEM ukjamawa.
Jiwasana uñakipañanxa, catabolismo BCAA ukaxa mä jach’a thakhi up-regulación ukar tukuwayi. Aka chiqaxa wali ch’amampiwa uñacht’ayi, volumen de ventilación ukaxa ciclo TCA ukar mantañatakixa mayjt’ayatarakispawa PN ukanxa jani OXPHOS ukanxa. Ukax mä jach’a forma de cableado metabólico neuronal ukar uñt’ayaspawa, ukax fisiología neuronal ukat jakañ tuqitx directo impacto ukaniwa, kunawsatix OXPHOS ukan sinti disfunción ukan mantenimiento ukanx. Aka hipótesis ukampi chika, jikxatawayapxaraktwa aka enzima anti-aterosclerótica principal PCx ukaxa up-regulada (Mfn2cKO/CTRL ukaxa mayjt’iwa niya 1,5 ukja; Figura 3A), ukaxa cataliza la conversión de la piruvato a oxaloacetato (28), ukaxa amuyatarakiwa tejido cerebral uksana La expresión en es restringida a astrocitos (29, 30). Aka proteómica lurawimpi chika, microscopía confocal uñacht’ayiwa expresión PCx ukaxa específicamente ukhamaraki wali jach’anchatawa PNs deficientes de OXPHOS uksana, ukatxa reactividad PCx ukaxa jilpachaxa restringida ukhamawa células gliales Bergmann adyacentes del control (Figure 3B). Uka funcionalmente yant’añatakixa uñjata upregulación PCx ukatxa, trazados agudos rebanadas cerebelosas con [1-13C]trazador de piruvato. Kunawsatixa piruvato ukaxa oxidado ukhama piruvato deshidrogenasa (PDH) ukampiwa, ukaxa etiqueta isótopo ukaxa chhaqtawayxiwa , Ukampisa uñakipatarakiw intermedios de ciclo TCA ukarux kunawsatix piruvato ukax metabolizado ukhama reacciones vasculares ukanakampi (Figure 3D). Jiwasana proteómica tuqita yatxatatanakasa yanapt’añatakixa, aka trazador uksatxa walja markachirinakawa uñjasiraki aka ácido aspartico de rebanadas Mfn2cKO uksana, ukatxa ácido cítrico ukatxa ácido málico ukaxa mä tendencia moderada ukhamarakiwa, jani ukaxa janiwa sinti jach’akisa (Figure 3D).
Aka neuronas dopaminas MitoPark ch’uqitxa disfunción mitocondrial ukampi luratarakiwa neuronas dopamina específicamente t’unjañataki aka gen factor de transcripción mitocondrial A (Tfam) (Figure S6B), expresión PCx ukaxa wali jach’a regulada ukhamarakiwa (31), ukaxa uñacht’ayiwa arteriosclerosis ácido acetona ukaxa regulada ukhamawa disfunción neuronal uka pachana OXPHOS ukax janchit uñt’atawa. Ukhamaraki, jikxatasiwa aka enzimas únicas (32-34) ukaxa uñacht’ayatarakiwa neuronas ukanakana ukaxa inasa arteriosclerosis ukampiwa chikañchasi, ukaxa wali jach’a regulada ukhamawa PNs ukanakana jani OXPHOS ukanxa, ukhamaraki propionil-CoA carboxilasa (PCC-A), Malonil-CoA ukaxa propionil-CoA ukarux succinil-CoA ukhamaraki enzima málica mitocondrial 3 (ME3) ukar tukuyi. ukaxa nayraqata lurawipaxa piruvato ukxa malato uksatxa kutt’ayañawa (Figure 3, A y C) (33, 35). Ukhamaraki, jikxatawayapxaraktwa mä jach’a jilxatawi aka enzima Pdk3, ukaxa fosforila ukhamaraki inactiva PDH (36), ukatxa janiwa mayjt’awinakaxa uñjasiwaykiti aka enzima Pdp1 ukaxa activa PDH jan ukaxa complejo enzima PDH pachpa (Figure 3A). Ukhamaraki, Mern2cKO PNs uksanxa, fosforilación de la subunidad α1 α (PDHE1α) subunidad de la componente de piruvato deshidrogenasa E1 del complejo PDH en Ser293 (uñt’atawa actividad enzima PDH uksa tuqita jark’aqañataki) ( Figura S6C) (Figure S6C). Piruvato ukaxa janiwa vasculares ukanakaru mantañapakiti.
Tukuyañatakixa, jikxatawayapxaraktwa aka super vía de biosíntesis de serina y glicina, ciclo de folato mitocondrial (1C) relacionado ukhamaraki biosíntesis de prolina (Figure 1G y Figura S5C) taqpachaxa wali jach’a up-regulada ukhamawa, yatiyawinakarujama, proceso de activación ukjakama. Uka muyuntat tejidos ukaxa activados ukhamaraki disfunción mitocondrial (5-7). Análisis confócal ukaxa aka proteómica uksa tuqita yanapt’añatakixa uñacht’ayiwa PN uksanxa OXPHOS chhaqhata, rebanadas cerebelosas de 8 semanas de ratas ukanakaxa serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2) ukampiwa uñakipata, ukaxa mä enzima clave ukhamawa ciclo de folato mitocondrial uksana. Wali jach’a inmunológica respuesta (Figure S5D). Aka 13 CU-glucosa-incubadas rebanadas agudas cerebelosas uksanxa, experimentos de rastreo metabólico ukaxa juk’ampi chiqapawa up-regulación de la biosíntesis de serina y prolina, ukaxa uñacht’ayiwa flujo de isoformas de carbono serina ukhamaraki prolina uksaru jilxatata (Figure S5E). Kunjamatixa reacciones promocionadas GLS ukatxa GPT2 ukaxa lurasirakiwa síntesis de glutamato glutamina ukatxa transaminación glutamato ukatxa α-cetoglutarato ukatxa, ukaxa uñacht’ayiwa upregulación ukaxa uñacht’ayiwa neuronas deficientes OXPHOS ukaxa mä jach’a mayiwi glutamato , Akaxa inasa amtatachispa mantener la biosíntesis jilxatata prolina (Figure S5C). Uka mayjt’awinakampi chika, mä análisis proteómico astrocitos cerebelares ukanakatxa PN-específicos Mfn2cKO ch’uqitxa uñacht’ayiwa aka thakhinakaxa (taqi antiperoxidasas ukanakampi) janiwa sinti mayjt’kiti expresión tuqina, ukhamarusa uñacht’ayatarakiwa Aka redirección metabólica ukaxa selectiva ukhamawa PN degradado (Fig. S6, D a G).
Mä juk’a arumpixa, aka análisis ukaxa uñacht’ayiwa wali mayja mayja patrón de activación temporal de vías metabólicas específicas PNs ukanakana. Ukhamaraki, función mitocondrial neuronal anormal ukaxa aterosclerosis nayraqataru ukhamaraki remodelación 1C ukaru puriyaspawa (Figure 3E ukatxa Figura S5C), ukhamaraki mayjt’awinakaxa predecibles expresión de complejos I ukatxa IV uksanxa, mayjt’awinakaxa síntesis de serina de novo uksanxa ukhamakiwa Ukaxa qhipa pachanakanxa qhanstawayi. OXPHOS ukan jan walt’awipa (3E uñacht’awi ukat S5C uñacht’awi). Aka yatxatawinakax mä proceso secuencial ukar uñt’ayi, ukanx mitocondrial (ciclo 1C) ukat citoplasmático (biosíntesis de serina) ukanakax sinérgicamente ukham jaysapxi, aterosclerosis ukan jilxatatapampi ciclo TCA ukanx metabolismo neuronal ukar wasitat uñstayañataki.
8 semanas de OXPHOS-deficientes PNs ukaxa actividad de excitación de alta frecuencia ukampi mantener ukhamaraki reconexión metabólica significativa ukampi compensar disfunción mitocondrial. Aka jikxatawixa mä suma amuyt’awi uñstayi, aka pachanxa, uka celulanakaxa ukhamaraki katuqapxarakispawa intervención terapéutica ukaxa qhiphart’ayañataki jan ukaxa jark’aqañataki neurodegeneración. Jayp'u. Uka posibilidad ukax pä independiente intervenciones ukanakampiw askichapxta. Nayraqata lurawixa, mä vector de virus adeno-asociado asociado (AAV) dependiente de Cre (AV) ukjamaraki MFN2 ukaxa selectivamente expresatäñapataki PNs deficientes de OXPHOS in vivo (Figure S7A). Aka AAV codificador MFN2 ukatxa gen reportero fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) ukaxa chiqapawa cultivos primarios de neuronas in vitro, ukaxa luraraki MFN2 ukaxa uñacht’ayatarakiwa mä Cre-dependiente ukhamaraki qhispiyarakiwa morfología mitocondrial, ukhamarusa jark’aqaraki neuromutación neuronas Mfn2cKO ( Figura S7, B, D y E). Ukxarusti, lurapxaraktwa experimentos in vivo ukhamata estereotácticamente puriyañataki 8 semanas Mfn2-AAV ukaxa corteza cerebelosa Mfn2cKO ukhamaraki control ch’uqiru, ukatxa análisis de 12 semanas de ratas (Figure 4A). Aka tratamiento Mfn2cKO ch’uqixa jiwatarakiwa (Figure 1, A y B) (16). Transducción viral in vivo ukjamaraki expresión selectiva de PN ukjamaraki yaqhipa círculos cerebelosos uksana (Figure S7, G y H). Aka inyección de AAV control ukaxa mCherry (Ctrl-AAV) ukaki expresa ukaxa janiwa mä jach’a efectos uñacht’aykiti grado de neurodegeneración Mfn2cKO uywanakaru. Ukasti, análisis de Mfn2cKOs transducidos con Mfn2-AAV uñacht’ayiwa mä jach’a jark’aqaña capa celular PN (Figure 4, B y C). Jisk’apachaxa, densidad neuronales ukaxa niya jani yaqhachañjamawa control uywanakatxa (Figure 4, B y C, y Figura S7, H y I). Aka expresión de MFN1 ukampisa janiwa MFN2 ukaxa mä khuskhaki wali askiwa neuronal jiwata qhispiyañataki (Figure 4C y Figura S7, C y F), ukaxa uñacht’ayiwa expresión de MFN1 ectópico ukaxa wali sumawa yapxataspa MFN2 jan utjatapata. Juk’ampi análisis ukaxa sapa nivel PN uksanxa uñacht’ayiwa Mfn2-AAV ukaxa jilpachawa qhispiyaraki ultraestructura de mitocondrias uksa tuqita, normaliza niveles de ADNmt uksa tuqita, ukhamaraki revertir la alta expresión del marcador anti-angiogénesis PCx (Figure 4, C a E). Uñakipaña uñjañaxa qhispiyata Mfn2cKO ch’uqitxa estado de descanso ukanxa uñacht’ayiwa postura ukhamaraki síntomas motores (movimiento S1 a S3) ukanakaxa suma uñjata. Tukuyañatakixa, aka yant’awinakaxa uñacht’ayiwa MFN2 ukaxa qhipa pachata mayampi PNs ukanakaru sinti pist’ata OXPHOS uksanxa, ukaxa wakisiwa ADNm uksa manq’añatakixa mayjt’ayañataki ukhamaraki aterosclerosis uksa tuqiru, ukhamata jark’aqañataki degeneración axónica ukhamaraki neuronal jiwata in vivo.
(A) Mä esquema uñacht’ayiwa horario experimental inyectar AAV codificador MFN2 ukaxa kunapachatixa uñacht’ayata metabólico thakhixa activado ukhama. (B) Fotografías confocales representativas de secciones cerebelosas de 12 semanas transducidas con ratas Mfn2cKO 8 semanas ukjamaraki etiquetadas anticuerpo anti-Calbindin ukampi. Kupi: Fibras axónicas ukanakan escamapa. Uka escala de zoom axónico ukaxa 450 ukhamaraki 75 μm ukjawa. (C) Ch’iqa: Cuantificación de la densidad celular de Purkinje en la bucle de transducción AAV (AAV+) (análisis de varianza de una vía; n = 3 ratas). Kupi: análisis de foco de ADNmt PN transducido uksanxa 12 semananxa (prueba t no pareada; n = 6 células kimsa ch’uqitxa). * P <0,05 ukja; ** P <0,01 ukjawa. (D) Micrografías electrónicas de transmisión representativas de PNs de secciones cerebelosas Mfn2cKO transducidas ukampi vectores virales uñacht’ayatanakampi. Rosa mascara ukax dendritas ukanakax kawkhans jikxatasi uk uñacht’ayi, ukatx q’illu ch’ankha chimpunakax ch’iqa tuqin zoom uñacht’ayi; n ukax núcleo ukar uñtasitawa. Barra de escala, 1μm. (E) uñacht’ayiwa mä uñacht’awi tinción PCx PN transducido 12 semanas. Barra de escala, 20μm. OE, ukat juk’ampi uñacht’ayaña; FC, pliegue mayjt’ayaña.
Tukuyañatakixa, yatxatapxaraktwa kunjamasa peroxidasa ukampiwa celulanakaxa jakasipxi PNs ukanakana, jupanakaxa OXPHOS disfunción ukanipxiwa. Jiwasaxa mCherry codificador AAV-shRNA (ARN corto de horquilla) específicamente dirigindo ARNm PCx de rata (AAV-shPCx), ukatxa inyectar virus jan ukaxa control revuelto (AAV-scr) cerebelo de ratas Mfn2cKO. Aka inyección ukaxa luratarakiwa pusi semana de edad (Figure 5A) ukhamata suma knockdown PCx ukaru puriñapataki aka pachana kunapachatixa expresión PCx ukaxa jilxati (Figure 3C) ukhamaraki capa celular PN ukaxa wali sumawa (Figure 1A). Ukhamaraki, PCx uksa tuqiru t’unjañatakixa (Figure S8A) ukaxa mä jach’a aceleración PN jiwataruwa puriyi, ukaxa sapa anillo restringido de infección ukawa (Figure 5, B y C). Ukhamarusa, aka mecanismo de los efectos metabólicos inducidos por PCx ​​up-regulation, yatxatapxaraktwa estado redox de PNs ukatxa PCx knockdown ukatxa AAV-mediado biosensor óptico Grx1-roGFP2 ukaxa mä pachana expresatarakiwa (Figure S8, B a D) ukhamata glutatión uñakipañataki El cambio relativo del potencial redox péptido (38). Ukxarusti, microscopía de imagen de vida de fluorescencia de dos fotones (FLIM) ukjamaraki rebanadas agudas cerebrales de Mfn2cKO de 7 semanas de Mfn2cKO jan ukaxa control littermates ukanakampi luratarakiwa, ukhamata yatxatañataki cambios potenciales en estado redox citoplasmático ukjamaraki condiciones FLIM ukanaka chiqaparu uñjasa (Figure S8, E a G). Aka análisis ukaxa uñacht’ayiwa mä jach’a jilxatawi estado de oxidación ukaxa mä sapa Mfn2cKO PNs ukaxa janiwa expresión PCx ukampi utjkiti, ukaxa mayjawa neuronas control ukatxa Mfn2cKO PNs ukatxa expresa shRNA revuelto ukaki (Figure 5, D y E). Kunawsatixa PCx expresión ukaxa down-regulada ukhama, sapa patakata Mfn2cKO PNs uñacht’ayata mä estado altamente oxidado ukaxa jilxatarakiwa kimsa kuti jila (Figure 5E), ukaxa uñacht’ayiwa PCx up-regulación ukaxa mantiwa capacidad redox de neuronas degeneradas.
(A) Mä esquema uñacht’ayiwa horario experimental inyectar AAV codificador shPCx ukaxa kunapachatixa uñacht’ayata thakhi metabólico ukaxa activado ukhama. (B) Fotografías confocales representativas de secciones cerebelosas de 8 semanas en ratas Mfn2cKO transducidas ukatxa etiquetadas anticuerpo anti-calcineurina ukampi 4 semanas ukjakama. Barra de escala, 450μm ukhawa. (C) Cuantificación de la densidad celular de Purkinje en lazos transducidos por AAV (análisis de varianza de una vía; n = 3 a 4 ratas). Uka yatxatawixa promedio±SEM ukjamawa; ***P<0,001 ukhawa. (D) Representante FLIM uñacht’awixa uñacht’ayiwa promedio de vida 7 semanas de PN expresadora de sensor redox de glutatión Grx1-roGFP2 ukaxa condiciones experimentales especificadas ukanakampi. LUT (tabla uñakipañ) ratio: jakañ pacha (picosegundos ukan). Barra de escala, 25μm ukhawa. (E) Histograma ukaxa uñacht’ayiwa distribución de valores de vida Grx1-roGFP2 (D) uksatxa (n=158 a 368 celulas pä ch’uqitxa sapa condición ukanxa). Aka gráfico de torta sapa histograma: uñacht’ayiwa qhawqha celulanakas wali jaya (wila, oxidada) jan ukaxa jisk’a (azul, jisk’achata) jakawimpi, ukaxa 1 SD ukjatxa jilawa CTRL-AAV-scr uksanxa. (F) Aka modelo propuesto ukaxa uñacht’ayiwa efecto protector de upregulación de PCx neuronal.
Taqi kuna, aka chiqan uñacht’ayata yatiyawinakax uñacht’ayiwa, MFN2 ukan wasitat uñacht’ayawipax taqpach qhispiyaspawa PN avanzado ukarux sinti OXPHOS ukan jan walt’awipampi, sinti ADNmt ukan pist’atapampi, ukatx sinti jan normal ista ukar uñtasit morfología ukamp, ​​ukhamatw nayrar sartañax sarantaskaspa nayrar sartañ usunakans ukhamaraki. Neurodegeneración ukaxa reversible prueba uñacht’ayiwa etapa janïra celula jiwatapana. Aka grado de flexibilidad metabólica ukaxa juk’ampi ch’amanchatawa neuronas ukanakana aterosclerosis (mä cableado ciclo TCA) uñstayañataki, ukaxa jark’iwa expresión PCx PNs ukanakana jani OXPHOS ukani ukhamaraki celula jiwata ch’amancharaki, ukhamarusa mä rol protector ukaniwa (Figure 5F).
Aka yatxatawinxa, uñacht’ayapxiwa mä chimpu uñacht’ayañataki PNs ukaxa OXPHOS disfunción ukaru jaysañatakixa juk’ata juk’ata convergen aterosclerosis ciclo TCA ukaru activación diferencial thakhi activada programas metabólicos ukanakampi. Jiwasaxa análisis proteómico ukxa walja métodos complementarios ukanakampiwa chiqanchapxtanxa, ukatxa uñacht’ayapxaraktwa kunapachatixa ch’amt’ataxa sinti disfunción mitocondrial ukampi, neuronas ukaxa mä forma de elasticidad metabólica nayraxa jani uñt’ata. Jiwasana muspharkañawa, taqpacha proceso de cableado ukaxa janiwa estado metabólico terminal ukaru uñt’aykiti, ukaxa neurodegeneración ukampi chika juk’ata juk’ata ukhamaraki irreversible ukhama, ukampisa jiwasana yatxatatanakasaxa uñacht’ayiwa, ukaxa mä neurona de mantenimiento ukhamawa, ukaxa inasa etapa janïra célula jiwatapana Mecanismo de compensación funcional. Aka jikxatawixa uñacht’ayiwa neuronas ukanakaxa mä jach’a grado de plasticidad metabólica ukaniwa cuerponxa. Aka chiqaxa uñacht’ayiwa qhiparu MFN2 uksa tuqita mayampi uñstayawixa expresión de marcadores metabólicos claves uksa tuqiruxa kutt’ayaspawa ukhamaraki degeneración PN uksa jark’aqaspawa. Jan ukasti, aterosclerosis sat usut jarkʼaqaraki ukat nervionakaruw jankʼak puriyi. transsexual ukax mä juk’a pachanakanwa.
Mä jach’a jikxatawixa jiwasana yatxatawinxa wali muspharkañawa, PNs jan OXPHOS ukampixa metabolismo ciclo TCA ukarux mayjt’ayaspawa, enzimas ukar regulación ukar jilxatayasa, ukax específicamente arteriosclerosis ukarux ch’amancharaki. Reordenamiento metabólico ukaxa mä aski lurawiwa células cancerosas ukatxa, yaqhipaxa glutamina ukaru atinisipxiwa intermedios de ciclo TCA ukaru yapxatañataki equivalentes reductores ukanaka lurañataki, ukaxa cadena respiratoria ukaru irpxaruwayi ukhamaraki mantener la producción de precursores de biosíntesis de lípidos y nucleótidos (39 , 40). Mä jichha yatxatawixa uñacht’ayiwa tejidos periféricos ukanxa disfunción OXPHOS ukanxa, reconexión metabolismo glutamina/glutamato ukaxa mä jach’a uñacht’awiwa (5, 41), kawkhantixa dirección de entrada de glutamina al ciclo TCA ukaxa depende De la severidad de la lesión de OXPHOS (41). ). Ukampirus, janiw qhan uñacht’awinakax utjkiti kunayman uñtasita plasticidad metabólica neuronal cuerpon ukhamarak inas relevancia ukax contexto de enfermedades ukanx utjaspa. Mä jichha yatxatawi in vitro ukanxa, neuronas corticales primarias ukanakaxa uñacht’ayatarakiwa movilizar piscinas de glutamato neurotransmisión ukataki, ukhamata metabolismo oxidativo ukhamaraki aterosclerosis ukanakaru ch’amanchañataki condiciones de estrés metabólico ukanxa (42). Ukhamaraki, aka inhibición farmacológica ukampi aka enzima de ciclo TCA succinato deshidrogenasa, carboxilación de piruvato ukaxa amuyatarakiwa mantener la síntesis de oxaloacetato en neuronas gránulo cerebelosa cultivadas (34). Ukampirusa, relevancia fisiológica uka mecanismos ukaxa tejidos cerebrales ukaru (kawkhantixa aterosclerosis ukaxa jilpachaxa astrocitos ukanakaru uñtatawa) wali wakiskiri significación fisiológica ukaniwa (43). Aka tuqinxa, jiwasana yatxatatanakasaxa uñacht’ayiwa PNs jan walt’ayata OXPHOS ukjamaraki cuerpo uksanxa mayjt’ayatarakispawa degradación BCAA ukhamaraki carboxilación piruvato ukanakaru, ukaxa pä jach’a fuentes de suplementación de intermedios de piscina TCA. Ukhamaraki, aka aporte putativo catabolismo BCAA ukaxa metabolismo energético neuronal ukaruxa uñacht’ayatarakiwa, ukatxa glutamato ukatxa GABA ukaxa neurotransmisión ukatakixa lurawipaxa ( 44 ), ukampirusa janiwa utjkiti mä chimpu aka mecanismos in vivo. Ukhamarusa, jasakiwa amuyt’aña PNs disfuncionales ukaxa automáticamente compensar la consumo de intermedios TCA impulsados ​​por el proceso de asimilación ukampi aterosclerosis jilxatayasa. Jisk’a tuqitxa, upregulación de PCx ukaxa wakisirakispawa mä jilxatata mayiwi ácido aspartico uksa tuqita, ukaxa uñacht’ayatarakiwa células proliferantes ukanakana disfunción mitocondrial ukampi (45). Ukampirusa, jiwasana análisis metabolómica ukaxa janiwa uñacht’aykiti kuna jach’a mayjt’awinaka nivel de estado estable de ácido aspartico ukanxa Mfn2cKO PNs ukanxa (Figure S6A), ukaxa amuyatarakiwa kunaymana utilización metabólica de ácido aspartico ukanxa células proliferantes ukhamaraki neuronas post-mitóticas ukanaka taypina . Ukhamaraki, mecanismo exacto de upregulación de PCx en neuronas disfuncionales in vivo ukaxa janiwa uñt’atäkiti, ukampirusa uñacht’ayapxaraktwa aka janïra pacharu jaysawixa mä wakiskir lurawiwa estado redox de neuronas ukanakaru uñjañataki, ukaxa uñacht’ayatarakiwa experimentos FLIM ukanxa rebanadas cerebelosas ukanakana. Jisk’a tuqitxa, PNs ukanakar PCx ​​ukar regulación ukar jark’aqañax estado juk’amp oxidado ukar puriyaspawa ukat células jiwatax jank’akiw lurasispa. Aka activación degradación BCAA ukatxa carboxilación de piruvato ukaxa janiwa thakhinakakiti caracterización de tejidos periféricos de la disfunción mitocondrial (7). Ukatwa, jupanakax neuronas deficientes OXPHOS ukanakatakix nayrïr chimpunïkaspas ukhamawa, janis ukakipkarakiw uñacht’ayatäkchixa, ukax neurodegeneración ukatakix wali askiwa. .
Cerebelosa usuxa mä heterogéneo tipo de neurodegenerativa usuniwa ukaxa jilpachaxa ataxia ukhama uñacht’ayasi ukatxa walja kutiwa PNs ukanakaruxa jan walt’ayi (46). Aka población neuronas ukaxa juk’ampi vulnerables ukhamawa disfunción mitocondrial ukaru kunatixa degeneración selectiva ukaxa ch’uqitxa suficiente ukhamawa walja síntomas motores ukanaka uñstayañataki ukaxa caracteriza la ataxia espinocerebelosa humana (16, 47, 48). Yatiyawinakarjamaxa, mä modelo transgénico de rata ukaxa mä gen mutante ukampixa jaqina ataxia espinocerebelosa ukampiwa chikañchasi ukatxa disfunción mitocondrial ukampiwa ( 49 , 50 ), ukaxa qhananchawa kunatixa wakisi yatxatañataki consecuencias de la deficiencia OXPHOS en PNPH. Ukatwa, uka jan uñt’at neuronas ukar sum yaqhawjar jaqukipañataki ukat yatxatañatakix juk’amp askiwa. Ukampirusa, PNs ukaxa wali sensibles ukhamawa presión ukatxa mä jisk’a proporción taqpacha células cerebelosa ukatxa, walja yatxatawinakaxa ómicas ukanakampi, separación selectiva ukanakaxa células enteras ukhamxa wali ch’amäspawa. Ukhamaraki, niyas jani ch’amakïkchixa jani absoluta falta de contaminación yaqha tipos celulares (juk’ampirusa tejidos adultos) ukanakaru puriñjamakchixa, mä efectivo paso de disociación FACS ukampiwa mayachasipxta ukhamata mä suficiente número de neuronas viables ukanaka apsuñataki análisis proteómico aguas abajo ukataki, ukatxa mä cobertura proteica Bastante jach’a (niya 3000 proteínas) ukanakampi chikachasiñataki kunatixa utjki uka conjunto de datos taqpacha cerebelo (51). Aka viabilidad de células enteras ukanaka jark’aqasaxa, aka lurawixa aka tuqina churatäki ukaxa janiwa mitocondrias uksana metabólicos thakhi mayjt’awinaka uñakipañakikiti, jan ukasti citoplasmáticos ukanakan mayjt’awinakapata uñakipañataki, ukaxa complementa el enriquecimiento de etiquetas de membrana mitocondrial específica a tipos celulares uka apnaqaña Machaq lurawixa mitocondrias ukanakana jakhthapita tejidos complejos ukanakana (52, 53). Aka lurawixa qhananchatawa janiwa células Purkinje ukanaka yatxatañakikiti, jan ukasti jasakiwa kunaymana kasta celulanakarusa apnaqasispa, ukhamata usut p’iqin metabólico mayjt’awinaka uñjañataki, ukhamaraki yaqha modelos de disfunción mitocondrial ukanakampi.
Tukuyañatakixa, mä ventana terapéutica uñt’apxta aka proceso de reordenamiento metabólico uka pachana ukaxa taqpacha kutt’ayaspawa señales claves de estrés celular ukatxa jark’aqaspawa degeneración neuronal. Ukhamarusa, aka chiqan qhanañchata cableado ukan implicaciones funcionales ukanaka amuyañaxa, fundamentales amuyunaka churaspawa, kuna qullanakas utjaspa, ukhamata viabilidad neuronal ukaxa utjañapataki, disfunción mitocondrial uka pachana. Jutïr yatxatäwinakax metabolismo energético ukan mayjt’awinakap yaqha kasta células cerebrales ukan mayjt’awinak diseccionañatakiw wakisi, ukhamat uka kamachix yaqha neurológicos usunakar apnaqañapatak taqpach uñacht’ayañataki.
MitoPark ch’uqixa nayraqata uñakipatawa (31). C57BL/6N ch’uqimpi loxP flanqueante Mfn2 ch’uqimpixa nayraqata qhananchatarakiwa (18) ukhamaraki ch’uqimpi L7-Cre ch’uqimpi (23). Ukxarusti, uka doble progenie heterocigótica ukaxa ch’amanchatarakiwa homocigóticos Mfn2loxP/Mfn2loxP ch’uqimpi ukhamata Purkinje-específicos gen knockouts Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) uksa lurañataki. Mä subconjunto de apareamiento uksanxa, alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) ukaxa uñt’ayatarakiwa yaqha cruzamientos ukanakampi (20). Taqi uywa lurawinakaxa luratarakiwa guias europeas, nacional ukhamaraki institucionales ukanakampi ukhamaraki LandesamtfürNatur de Umwelt ukhamaraki Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania ukanakana iyawsatapampi. Uywanakan irnaqawipax Federación Europea de Asociaciones de Ciencias Animales de Laboratorio ukan irnaqawiparjamaw lurasiraki.
Ususiri warmin dislocación cervical ukar anestesia churañ tukuyasaxa, ch’uqi embrión ukaw yaqhawjar jaqukipata (E13). Aka corteza ukxa diseccionata Solución de Sal Equilibrado de Hanks (HBSS) ukjamaraki 10 mM Hepes ukjamaraki pasatarakiwa Medio de Águila Modificado de Dulbecco ukjamaraki papaína (20 U/ml) ukhamaraki cisteína (1μg/ml) ukanakampi. Aka tejido ukaxa DMEM uksanwa incubada) ukatxa disociación digestión enzimática tuqiwa lurataraki. Ml) 37 °C ukjamaru 20 minutos ukjamaru, ukxaruxa mecánicamente molienda DMEM ukjamaraki 10% suero fetal bovino ukjamaraki. Células ukxa yapuchatarakiwa tapa de vidrio ukjamaraki polilisina ukjamaraki densidad 2×106 sapa plato de cultivo 6 cm ukjamaraki densidad 0,5×105 células/cm2 ukjamaraki análisis de imagen ukjamaraki. 4 horas ukjaxa, medio ukaxa mayjt’ayatarakiwa medio libre de suero Neurobasal ukampi, ukaxa 1% suplemento B27 ukampi 0,5 mM GlutaMax ukampi. Ukatxa neuronas ukaxa 37°C ukhamaraki 5% CO2 ukjamawa yant’awi tukuykama, ukatxa semananxa mä kutiwa manq’ayataraki. Aka recombinación in vitro uksa lurañatakixa, 3μl (plato de cultivo de 24 pozos) jan ukaxa 0,5μl (placa de 24 pozos) ukjamaraki aka vector virus AAV9 ukjamaraki neuronas ukjamaraki payïri uru in vitro ukjamaraki: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, catálogo jakhu 105530-AAV9) ukhamaraki AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catálogo jakhu 105545-AAV9).
ADN complementario Mfn1 ukatxa Mfn2 de rata (plásmido Addgene #23212 ukatxa #23213 uksatxa apsutarakiwa) ukaxa secuencia V5 (GKPIPNPLLGLDST) ukampiwa chimpuntataraki C-terminal uksana, ukatxa mCherry ukampiwa fusionataraki marco ukanxa secuencia T2A tuqi. Grx1-roGFP2 ukax Heidelberg T. P. Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ukan mä regalopawa. Aka tdTomato cassette ukxa mayjt’ayatarakiwa convencionales métodos de clonación ukampi, aka cassette ukaxa subclonado ukjamaraki pAAV-CAG-FLEX-tdTomato columna vertebral (Addgene referencia número 28306) ukjamaraki pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ukjamaraki pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. Ukhamaraki, aka estrategia ukaxa luratarakiwa vector control pAAV-CAG-FLEX-mCherry uksa lurañataki. Aka AAV-shPCx lurawi lurañatakixa, mä vector AAV plásmido (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ukawa wakisi, ukaxa aka secuencia de ADN ukampi codificada shRNA ukaru uñtatawa PCx de rata (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) U6 promotor ukan controlatapampixa, mCherry ukaxa CMV promotor ukan controlatapampiwa apnaqatarakini. Aka vectores auxiliares AAV uksa lurawixa luratarakiwa lurawi tuqita (Cell Biolabs). Mä juk’a arumpixa, mä plásmido de transferencia ukampiwa mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transitoriamente Transfección de células 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) jan ukaxa Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) codificador gen, ukhamaraki codificador proteína cápsida AAV1 ukatxa proteína accesoria Plásmido plásmido de empaquetado, método de fosfato de cálcio ukampi. Aka crudo sobrenadante de virus ukaxa apsutarakiwa ciclos de congelación-descongelación ukjamaraki baño de hielo seco/etanol ukjamaraki células lisas ukjamaraki salina tamponada fosfato (PBS) ukjamaraki. Aka vector AAV ukaxa puriyatarakiwa ultracentrifugación discontinua de gradiente de iodixanol (24 horas a 32.000 rpm y 4 °C) ukjamaraki concentrado ukjamaraki filtro centrífuga Amicon ultra-15 ukampiwa. Título genoma AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copia genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ukaxa kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata (54), uñakipata PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) . -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) ukhamaraki AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml) ukanakampi.
Neuronas primarias ukaxa raspado ukhamawa hielo-t’uma 1x PBS, pellet, ukxaruxa homogeneizadas en 0,5% desoxicolato de sodio/tampón de lisis de PBS con fosfatasa y inhibidor de proteasa (Roche). Aka cuantificación proteica ukaxa luratarakiwa ensayo de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific) ukampiwa. Ukxarusti, proteínas ukanakaxa electroforesis de gel SDS-poliacrilamida ukampiwa jaljataraki, ukatxa blotatarakiwa mä membrana de flúor de polivinilideno (GE Healthcare) ukarjama. Bloquear sitios no específicos ukatxa incubar anticuerpo primario (uñxatma Tabla S1 ukatxa juk’ampi yatxatañataki) 5% leche TBST (salina tamponada Tris con Tween), jariña lurawi ukhamaraki anticuerpo secundario TBST Incubar. Aka anticuerpo primario ukampiwa mä aruma +4°C ukjamaru incubada. Jariña tukuyatatxa, anticuerpo secundario ukaxa 2 horas temperatura ambiente ukjamaru uchañawa. Ukxarusti, pachpa blot ukampi anticuerpo anti-β-actina ukampiwa incubada, ukatxa pachpa carga ukaxa chiqapawa. Uñt’añatakixa quimiluminescencia ukar jaqukipaña ukhamaraki quimioluminescencia (GE Healthcare) ukar ch’amanchaña.
Aka neuronas nayraqata jathata laminas de vidrio ukjamaraki 4% paraformaldehído (PFA)/PBS ukjamaraki especificado pachana temperatura ambiente ukjamaraki 10 minutos ukjamawa. Aka laminas de tapa ukaxa nayraqata permeada 0,1% Triton X-100/PBS 5 minutos temperatura ambiente ukjamaraki, ukxaruxa tampón bloqueante [3% albúmina de suero bovino (BSA)/PBS]. Payïri uruxa, laminas de tapa ukaxa jariqatarakiwa tampón bloqueante ukampi ukatxa incubadas con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado ukampi 2 horas temperatura ambiente uksana; tukuyañatakixa, muestras ukaxa suma jariqatarakiwa PBS ukjamaraki 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) ukjamaraki contratinción ukjamaraki fijada la diapositiva de microscopio ukjamaraki Aqua-Poly/Mount.
Ch’uqi (chacha warmi) anestesia ukjamaraki inyección intraperitoneal de ketamina (130 mg/kg) ukhamaraki xilazina (10 mg/kg) ukjamaraki subcutánea ukjamaraki carprofeno analgésico (5 mg/kg) , Ukatxa mä instrumento estereotáctico (Kopf) equipado con un almohadilla caliente. P’iqi ch’akha uñacht’ayaña ukatxa taladro dental ukampiwa corteza cerebelosa uksana chiqapa jisk’achaña, ukaxa mis ch’akharu uñtasitawa (lambda uksatxa: chuyma 1,8, lateral 1, lóbulo IV ukatxa V ukarjama). Mä aguja de jeringa curva ukampiwa wali amuyumpi mä jisk’a p’iya luraña p’iqiru, ukhamata jani vasculatura alayaru jan walt’ayañataki. Ukxarusti jisk’a dibujado capilar de vidrio ukaxa juk’ata juk’ata micro-hoyo uksaru uchatarakiwa (-1,3 uksatxa -1 uksaruwa ventral lado dura mater uksaru), ukatxa 200 a 300 nl AAV uksaruwa inyectaraki micro-inyector (Narishige) uksaru jeringas manuales (Narishige) ukanakampi walja kuti jisk’a presión ukanxa 10 a 20 minutos ukja ventana. Infusión ukxaruxa, capilar ukaxa yaqha 10 minutos ukjamawa uchaña, ukhamata virus ukaxa taqpacha jilxatañapataki. Capilaranakax apsutäxi uka qhipatxa, ñik’utax wali suma suturampiw ch’uqt’asi, ukhamat usuchjat jan inflamación ukat uywax waliptañapataki. Uywanakaxa walja urunakawa analgésicos (caspofeno) ukampiwa qullataraki, ukatxa uka pachanxa wali suma uñjatarakiwa kunjamasa jañchipaxa ukxaruxa eutanasia ukaxa luratarakiwa uka pachana qhananchata pachana. Taqi lurawinakaxa luratarakiwa Europa, nacional ukhamaraki institucional ukanakana kamachinakaparjama ukhamaraki LandesamtfürNatur de Umwelt ukhamaraki Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania ukanakana iyawsatapampi.
Uywanakaruxa anestesia ukjamaraki ketamina (100 mg/kg) ukhamaraki xilazina (10 mg/kg) ukanakampiwa lurataraki, ukatxa chuymaxa perfusionarakiwa 0,1 M PBS nayraqata, ukxaruxa 4% PFA PBS ukjamaraki. Aka tejido ukxa diseccionata ukhamaraki fijada 4% PFA/PBS ukjamaraki mä aruma 4 °C ukjamaru. Mä cuchillo vibrante (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) ukjamaraki secciones sagitales (50 μm thiya) wakicht’atarakiwa fijo p’iqitxa PBS uksana. Jani yaqha tuqita qhananchata, tinción de secciones libres flotantes ukaxa luratarakiwa kunjamatixa nayraqata (13) uñacht’ayata temperatura ambiente ukjamaraki ch’axwaña. Mä juk’a arumpixa, nayraqata, aka apsutanakaxa permeabilizadas 0,5% Triton X-100/PBS ukjamaraki 15 minutos ukjamaraki temperatura ambiente ukjamaraki; yaqhipa epítopos (Pcx ukatxa Shmt2), por en tampón tris-EDTA a 80 °C (PH 9) ukjamaraki 25 minutos ukjamawa aka lurawixa. Ukxarusti, t’aqanakaxa incubadas con anticuerpo primario (uñxatma Tabla S1) tampón bloqueante (3% BSA/PBS) ukjamaraki 4 °C ukjamaru mä aruma ch’allt’ata. Qhipüruxa, t’aqanakaxa tampón bloqueante ukampiwa jariqataraki ukatxa incubadas con anticuerpo secundario conjugado a fluoróforo apropiado ukampiwa 2 horas temperatura ambiente uksana; tukuyañatakixa, t’aqanakaxa PBS uksanwa suma jariqata, contra-tinción DAPI ukampiwa, ukxaruxa AquaPolymount On a microscopio diapositiva ukampiwa askichataraki.
Mä microscopio confocal de escaneo láser (TCS SP8-X jan ukaxa TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ukampiwa janq’u qhana láser ukampi 405 diodo ultravioleta láser ukampiwa muestra uñacht’ayañatakixa apnaqatarakiwa. Fluoróforo uksa tuqita ch’amanchasa ukhamaraki Detector Híbrido (HyDs) ukampiwa señal apthapita, software LAS-X ukaxa apnaqatarakiwa apilado uñacht’awinaka apthapiñatakixa muestreo Nyquist ukarjama modo secuencial ukanxa: paneles no cuantitativos ukanakatakixa, ukaxa señales altamente dinámicas (santi, células somáticas ukhamaraki dendritas ukanakana) mtYFP) HyD ukampiwa PNs ukanakaxa qhawqhasa utji modo BrightR ukanxa uñt’añataki). Gating 0,3 ukatxa 6 ns ukjaruwa lurataraki, ukhamata qhipa uñtawi jisk’achañataki.
Chiqpach pachan uñacht’ayaña celulas ordenadas ukanaka. Ukxarusti, medio Neurobasal-A ukjamaraki 1% suplemento B27 ukjamaraki 0,5 mM GlutaMax ukjamaraki, celulanakaxa jank’akiw yapuchataraki diapositivas de vidrio revestidas por poli-l-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, número de catálogo 80826) , Ukatxa 37 °C ukhamaraki 5% CO2 ukjamaraki 1 hora ukjamaraki celulanakaxa utt’ayatarakiwa. Imágenes en tiempo real ukaxa luratarakiwa microscopio confocal de escaneo láser Leica SP8 ukampi, ukaxa mä janq’u láser, HyD, 63×[1,4 apertura numérica (NA)] lente objetivo de aceite ukampi ukhamaraki etapa de calentamiento ukampi.
Uka ch’uqixa jank’akiw dióxido de carbono ukamp anestesia ukat p’iqip khuchhurata, p’iqix jank’akiw p’iqit apsutäna, ukatx 200μm thiyaruw khuchhurata (experimento de etiquetado 13C ukataki) jan ukax 275μm thiya (pä experimento de fotones ukataki) sección sagital phuqt’ata aka materiales Helado (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) . ukjamaraki aka sustancias ukanakampi phuqt’ata: 125 mM hielo-t’unjata, carbono-saturado (95% O2 ukhamaraki 5% CO2) jisk’a Ca2 + líquido cerebroespinal artificial (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucosa, 0,5 mM CaCl2 ukatxa 3,5 mM MgCl2 (presión osmótica 310 a 330 mmol) ukjamaraki. Aka apsutanakaxa p’iqi ch’uqitxa apsutarakiwa mä cámara preincubación ukjamaraki juk’ampi jach’a Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 ukhamaraki 2,0 mM MgCl2). Medio) pH 7,4 ukatxa 310 ukatxa 320 mmol).
Uka imajinas lurawi taypinxa, rebanadas ukanakaxa mä sala dedicado de imagen ukarux apayatarakiwa, ukatxa yant’awixa luratarakiwa perfusión continua ACSF ukampiwa mä temperatura constante 32° a 33°C. Mä microscopio de escaneo láser multifotónico (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ukaxa mä lente objetivo Leica 25x (NA 0,95, uma), Ti: láser de zafiro (Chameleon Vision II, Coherent) ukampiwa lurataraki, ukaxa rebanada uñakipañatakixa apnaqatarakiwa. Módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant) ukax mä juk’a pachanakanwa.
FLIM ukax Grx1-roGFP2 ukankiwa. Mayjt’awinakaxa estado redox citoplasmático PNs uksanxa pä foton FLIM ukampiwa uñakipata, rebanadas sagitales de cerebro uksanxa, kawkhantixa biosensor Grx1-roGFP2 ukaxa PNs uksaruwa uñakipataraki. Aka capa PN uksanxa, campo de adquisición ukxa ajllitarakiwa niya 50 a 80 μm ukjamaru aka rebanada uksa tuqiru ukhamata utjañapataki mä PN viable (mä arunxa, jani estructura de cuentas jan ukaxa cambios morfológicos neuronales ukanakaxa dendritas uksa tuqina) ukhamaraki sensor doble positivo roGFP2 ukhamaraki AAV codificador shRNA PCx jan ukaxa secuencia de control (sapa mayni coexpresadora mCherry). Mä pila uñacht’awinaka 2x zoom digital ukampiwa apthapita [longitud de onda de excitación: 890 nm; 512 nm 512 píxeles ukhawa]. Detección: HyD interno, grupo de filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC)] ukhamaraki promedio de imágenes 2 a 3 minutos ukjakama luratarakiwa ukhamata suma fotones apthapita (1000 fotones taqpacha) curva uñakipañataki. Aka sensibilidad de la sonda Grx1-roGFP2 ukatxa verificación de condiciones FLIM ukaxa luratarakiwa uñjarakiwa valor de vida roGFP2 ukjamaraki exógeno 10 mM H2O2 ukjamaraki perfusión ACSF ukjamaraki (oxidación maximizar, ukaxa jilxatarakiwa jakawi), ukjamaraki 2 mM ditiotreitol (minimiza grado de reducción, ukjamaraki jakäwipanxa) (S8 uñacht’awi, D ukat G ukar puriñkama). Aka software FLIMfit 5.1.1 ukampi luratarakiwa, ukhamata apsutanaka uñakipañataki, ukhamaraki curva de decadencia exponencial sapa mayniru taqpacha uñacht’awiru IRF medido (función de respuesta instrumental) ukarjama, ukatxa χ2 ukaxa niya 1. Mä sapa PN ukana jakawipa jakhthapiñatakixa, mascara cuerpo nervioso muytapanxa amparampi apsutarakiwa, ukatxa sapa mascara ukanxa promedio de vida ukaxa cuantificación ukatakixa apnaqatarakiwa.
Análisis de potencial mitocondrial ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. Uka sección aguda ukxa incubada 100 nM TMRM directamente añadido a la ACSF perfundido 30 minutos ukjamaraki, PNs ukanakana mayjt’awinaka potencial mitocondrial ukanakaxa microscopio de dos fotones ukampiwa uñakipata. Imagen TMRM ukaxa luratarakiwa sonda excitación 920 nm ukjamaraki HyD interno (isotiocianato de tetrametilrodamina: 585/40 nm) ukampiwa señales apthapiñataki; pachpa longitud de onda de excitación ukampi ukampisa yaqha HyD interno (FITC :525/50) ukampi mtYFP uñacht’ayañataki. ImageJ ukaxa Image Calculator plugin ukampi luratawa, ukhamata mitocondrial uka ch’amampi chikachasiñataki nivel de célula única ukanxa. Mä juk’a arumpixa, ecuación plug-in: señal = min (mtYFP, TMRM) ukaxa apnaqatarakiwa uñt’añataki región mitocondrial ukaxa uñacht’ayiwa señal TMRM Purkinje somali ukanxa uñacht’ayiwa mä pila confocal ukanxa canal correspondiente ukanxa. Ukxarusti área de píxeles ukaxa mascara ukatxa apsutarakiwa cuantificada, ukatxa normalizada ukaxa correspondiente umbral único pila ukanxa canal mtYFP ukatxa fracción mitocondrial ukaxa uñacht’ayiwa potencial mitocondrial.
Uka uñacht’awix software Huygens Pro (Imagen de Volumen Científico) ukampiw desconvolucionata. Uka escaneado uñacht’awinakatakixa, mä sapa azulejo ukana montaje ukaxa luratarakiwa algoritmo automático de costura ukampi software LAS-X ukampi. Uñacht’awinak calibración tukuyatatxa, ImageJ ukat Adobe Photoshop ukampiw juk’amp uñacht’awinak lurañatakix ukat mä kipkak qhana ukat contraste ukar chiqanchañataki. Adobe Illustrator ukax gráfico wakicht’añatakiw apnaqasi.
mtDNA ukax foco uñakipaña. Aka lesiones de ADNmt ukaxa secciones cerebelosas ukanakanwa uñakipata, ukaxa anticuerpos contra ADN ukanakampiwa microscopio confocal ukampiwa uñakipata. Sapa área objetivo ukaxa luratarakiwa cuerpo celular ukhamaraki núcleo sapa celula ukataki, ukatxa área respectiva ukaxa jakhthapitawa plug-in Multi Measure (software ImageJ) ukampiwa. Uka área nuclear ukxa celula cuerpo uksatxa apsuñawa, ukhamata área citoplasmática uksa apsuñataki. Tukuyañatakixa, plug-in Analyze Particles (software ImageJ) ukampixa automáticamente uñakipatarakiw puntos de ADN citoplasmático ukanakax ADNmt uñacht’ayi umbral ukan uñacht’ayata, ukatx uka apsutanakax normalizadas ukhamawa promedio PN de ratas CTRL. Uka lurawixa uñacht’ayatawa mä promedio de nucleósidos sapa célula ukanxa.
Análisis de expresión proteica ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. ImageJ ukaxa Image Calculator plugin ukampi luratawa, ukhamata expresión proteica PN uksana nivel de célula única uksana uñakipañataki. Mä juk’a arumpixa, aka imagen confocal de una sola capa del canal correspondiente uksanxa, ecuación tuqi: señal = min (mtYFP, anticuerpo), región mitocondrial ukaxa inmunoreactividad uñacht’ayi mä anticuerpo Purkina uksana. Ukxarusti área de píxeles ukaxa mascara ukatxa apsutarakiwa cuantificada, ukxaruxa normalizada ukaxa correspondiente umbral único pila uñacht’awina canal mtYFP ukatxa fracción mitocondrial uka proteína uñacht’ayata apsuñataki.
Purkinje celular densidad uñakipaña. Aka plug-in de Contador de Células de ImageJ ukaxa densidad de Purkinje uñakipañatakixa apnaqatarakiwa, ukaxa jakthapitawa jakthapita celulas de Purkinje ukatxa anillo cerebelosa ukaxa jakthapita celulanakampi.
Muestra wakicht’aña ukatxa apthapiña. Aka p’iqinakaxa grupo control ukjamaraki Mfn2cKO ch’uqitxa fijatarakiwa 2% PFA/2,5% glutaraldehído ukjamaraki 0,1 M tampón fosfato (PB), ukjamaraki secciones coronales ukjamaraki wakicht’atarakiwa ciliados (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (Gruesor 50 a 60 μm) Ukxarusti fixatarakiwa tampón PB ukjamaraki 1% tetraóxido de os ukjamaraki 1,5% ferrocianuro de potasio ukjamaraki temperatura ambiente ukjamaraki 1 hora. Aka t’aqanakaxa kimsa kutiwa destilada umampi jariqataraki, ukxaruxa 70% etanol ukampiwa 1% acetato de uranilo ukampiwa 20 minutos ukjamaru ch’amanchataraki. Ukxarusti t’aqanakaxa deshidratado alcohol graduado ukjamaraki Durcupan ACM (resina de fundición Araldite M) resina epoxi (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 14040) ukjamaraki diapositivas de vidrio revestidas de silicio ukjamaraki 60 °C ukjamaru Polimerizar horno uksana 48 horas. Aka área de corteza cerebelosa ukxa ajllitarakiwa ukatxa 50 nm ultrafinas ukjamaraki Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) ukjamaraki apthapitawa mä rejilla de hendidura de cobre 2×1 mm ukjamaraki película de poliestireno ukampiwa. Aka t’aqanakaxa mä solución de acetato de uranilo 4% H2O ukjamaraki 10 minutos ukjamaraki H2O ukjamaraki walja kutiwa jariqataraki, ukxaruxa citrato de plomo Reynolds ukjamaraki H2O ukjamaraki 10 minutos ukjamaraki H2O ukjamaraki walja kutiwa jariqataraki. Micrografías ukaxa apsutarakiwa microscopio electrónico de transmisión Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) ukampiwa TVIPS (Sistema de Procesamiento de Video y Imagen Tietz) TemCam-F416 cámara digital (TVIPS GmbH, Gauting, EE.UU.) ukampiwa lurataraki. Alemania markanxa).
Ch’uqi AAV ukampiwa usuchjata, p’iqixa jaljatawa ukatxa 1 mm thiya sección sagital ukjamawa, ukatxa cerebelo ukaxa microscopio de fluorescencia ukampiwa uñakipata, ukhamata uñt’añataki anillo infectado AAV (mä arunxa, mCherry expresa). Uka yant’awinakakiwa kawkhantixa inyección AAV ukaxa wali jach’a eficiencia de transducción capa celular Purkinje (mä arunxa niya taqpacha capa) ukanxa pä anillo cerebelosa consecutivos ukanakanxa apnaqatarakiwa. Aka AAV-transducido bucle ukaxa microdiseccionado ukhamawa mä aruma post-fijación (4% PFA ukatxa 2,5% glutaraldehído en tampón de cocoato 0,1 M) ukatxa juk’ampi luratarakiwa. Aka EPON uñakipañatakixa, fijo tejido ukaxa jariqatarakiwa 0,1 M tampón de cocoato sódico (Applichem), ukjamaraki incubado 2% OsO4 (os, Servicios de Ciencias; Caco) ukjamaraki 0,1 M tampón de cocoato sódico (Applichem) 4 Horas, ukxaruxa 2 horas ukjamawa jaqukipataraki. Ukhama 3 kuti 0,1 M tampón cocamida ukampiwa lurataraki. Ukxarusti, serie ascendente de etanol ukjamaraki sapa solución de etanol ukjamaraki 4 °C ukjamaraki 15 minutos ukjamaraki deshidratación ukjamaraki tejido ukjamaraki. Aka tejido ukaxa óxido de propileno ukjamaraki mä arumawa EPON (Sigma-Aldrich) ukjamaraki 4 °C ukjamaru incubada. Aka tejido ukaxa fresco EPON ukjamaraki temperatura ambiente ukjamaraki 2 horas ukjamawa, ukxaruxa 62 °C ukjamaru 72 horas ukjamaru uchaña. Aka ultramicrotomo (Leica Microsystems, UC6) ukhamaraki cuchillo de diamante (Diatome, Biel, Suiza) ukanakampiwa 70 nm ultrafinas ukjamaru khuchhuqaña, ukatxa acetato de uranilo 1,5% ukampiwa 15 minutos 37 °C ukjamaru tintayataraki, ukatxa solución de citrato de plomo ukampiwa 4 minutos ukjamaru tintayataraki. Aka micrografías electrónicas ukaxa luratarakiwa mä microscopio electrónico de transmisión JEM-2100 Plus (JEOL) ukampiwa lurataraki, ukaxa Camera OneView 4K 4K 16-bit (Gatan) ukhamaraki software DigitalMicrograph (Gatan) ukanakampiwa lurataraki. Uka uñakipañatakixa, micrografías electrónicas ukanakaxa 5000× jan ukaxa 10.000× zoom digital ukampiwa apsutaraki.
Análisis morfológico ukaxa mitocondrias ukanakana uñakipatawa. Taqi análisis ukatakixa, sapa mitocondrias ukan contornos ukanakax manualmente uñacht’ayatawa imágenes digitales ukanxa software ImageJ ukampiwa. Kunayman parámetros morfológicos ukanakaw uñakipata. Densidad mitocondrial ukaxa sapa patakata sapa patakata apsutarakiwa taqpacha área mitocondrial sapa celula ukjamaraki área citoplasma (área citoplasma = área celular-área núcleo celular) × 100. Aka mitocondrias uksana muyuñapatakixa aka fórmula [4π∙(área/perímetro 2)] ukampiwa jakhthapita. Mitocondrias ukan morfología ista ukaxa uñakipatawa ukatxa pä categoría (“tubular” ukhamaraki “blister”) ukjaruwa jaljataraki, jach’a uñnaqaparjama.
Autofagosoma/lisosoma jakhuwi ukhamaraki densidad uñakipaña. Software ImageJ ukampixa sapa autofagosoma/lisosoma ukan contornos ukanakapa manualmente uñacht’ayañataki digital ukanxa. Aka área autofagosoma/lisosoma ukjamaraki sapa patakata jakhthapitawa taqpacha área de estructura autofagosoma/lisosoma sapa celula ukjamaraki área citoplasma ukjamaraki (área citoplasma=área celular-área núcleo)×100. Aka densidad de autofagosomas/lisosomas ukaxa jakhthapitawa taqpacha jakhthapita jakhuwimpi jakhuwi autofagosoma/lisosoma estructuras sapa celula tuqita (área citoplasmática tuqita) (área citoplasmática = área celular-área nuclear).
Etiquetado ukaxa sección aguda ukatxa muestra wakicht’añataki. Aka yant’awinakaxa etiquetado glucosa ukampi lurañatakixa, rebanadas agudas cerebrales ukanakaxa mä cámara preincubación ukarux apayatawa, ukaxa carbono saturado (95% O2 y 5% CO2), alto Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón de fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO 3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl 2 ukatxa 2,0 mM MgCl 2, ukjamaraki pH 7,4 ukjamaraki 310 ukjamaraki 320 mOsm), ukjamaraki glucosa ukjamaraki 13 C 6- Sustitución de glucosa (Eurisotop, número de catálogo CLM-1396). Uka yant’awinakatakixa piruvato etiquetado ukaxa wakisirakiwa, aka rebanadas agudas cerebrales ukanakaxa Ca2 + ACSF juk’ampi jach’a (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 ukjamaraki 2,0mM ukjamaru yapxataña MgCl2, ukjamaraki pH 7,4 ukjamaraki 310 ukjamaraki 320mOsm ukjamaraki 1mM 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, número de catálogo CLM-1082) ukjamaraki. Aka t’aqanakaxa 90 t’ijturjamawa 37 °C ukjamaru incubada. Aka yant’awi tukuyatatxa, t’aqanakaxa jank’akiw jariqataraki mä solución acuosa (pH 7,4) ukampiwa, ukaxa 75 mM carbonato de amonio ukjamaraki, ukxaruxa homogeneizada 40:40:20 (v:v:v) acetonitrilo (ACN): metanol: umampi. Uka t’aqanakaxa hielo ukjamaru 30 minutos ukjamaru incubadas ukxaruxa, muestras ukaxa centrifugadas 21.000 g ukjamaru 10 minutos ukjamaru 4 °C ukjamaru, ukatxa qhana sobrenadante ukxa wañt’ayatarakiwa concentrador SpeedVac ukjamaru. Aka waña pellet metabolito ukjamaraki -80 °C ukjamaraki análisis ukjamaraki.
Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas ukjamaraki 13 aminoácidos marcados C ukanakampi. Aka análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) ukjamaraki, aka pellet metabolito ukjamaraki 75μl de agua grado LC-MS (Honeywell) ukjamaraki. Ukxarusti centrifugación 21.000 g 5 minutos a 4 °C ukjamaraki 20 μl de sobrenadante clarificado ukjamaraki análisis de flujo de aminoácidos ukjamaraki, ukatxa qhipa extracto ukjamaraki jank’akirakiw análisis aniónico ukjamaraki (uñxatma amparampi). Aka análisis de aminoácidos ukjamaraki aka protocolo de derivatización cloruro de benzoílo (55, 56) nayraqata uñakipata. Nayraqata lurawixa, 10μl de carbonato de sodio 100 mM (Sigma-Aldrich) ukjamaraki 20μl ukjamaraki extracto de metabolito ukjamaraki 10μl de cloruro de benzoilo 2% (Sigma-Aldrich) ukjamaraki ACN grado LC ukjamaraki. Aka muestra ukxa mä juk’a vortex ukjamaraki centrifugada 21.000 g 5 minutos a 20 °C. Aka sobrenadante q’umachata ukxa mä vial automuestreador 2 ml ukjamaru puriyatarakiwa mä inserto de vidrio cónico (200 μl volumen) ukampiwa. Aka muestras ukanakaxa sistema LC ultra-alto rendimiento Acquity iClass (Waters) ukampiwa uñakipata, ukaxa espectrómetro de masas de precisión de alta resolución Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific) ukampiwa uñakipata. Análisis ukatakixa, 2μl de muestra derivada ukxa inyectarakiwa mä columna T3 de sílice de alta resistencia 100×1,0 mm (Uma) ukjamaraki 1,8μm ukja partículas ukanakampi. Aka caudal ukaxa 100μl/min ukjamawa, ukatxa sistema de tampón ukaxa tampón A (formato de amonio 10 mM ukhamaraki ácido fórmico 0,15% umaru) ukhamaraki tampón B (ACN) ukanakampiwa lurataraki. Gradiente ukaxa akhamawa: 0%B 0 minutos ukjakama; 0%B. 0 ukjamaraki 15% B ukjamaraki 0 ​​ukjamaraki 0,1 minutos ukjamawa; 15 ukatxa 17% B ukjamaraki 0,1 ukjamaraki 0,5 minutos ukjamawa; B ukjamaraki 17 ukjamaraki 55% ukjamaraki 0,5 ukjamaraki 14 minutos ukjamaraki; B ukaxa 55 ukatxa 70% ukjawa 14 ukatxa 14,5 minutos ukjakama; ukjamaraki 14,5 ukjamaraki 70 ukjamaraki 100% B ukjamaraki 18 minutos ukjamaraki; 100% B ukaxa 18 ukatxa 19 minutos ukjamawa; 100 ukjamaraki 0% B ukjamaraki 19 ukjamaraki 19,1 minutos ukjamawa; 0% B ukjamaraki 19,1 ukjamaraki 28 minutos ukjakama (55, 56). Aka espectrómetro de masas QE-HF ukaxa lurasirakiwa modo de ionización positiva ukjamaraki mä rango de masa m/z (ratio de masa/carga) 50 a 750. Aka resolución aplicada ukaxa 60.000 ukjawa, ukatxa control de ganancia (AGC) ukaxa objetivo de iones ukjamaraki 3×106 ukjawa, ukatxa tiempo máximo de iones ukaxa 100 milisegundos ukjawa. Aka ionización electrospray calentada (ESI) ukaxa lurasirakiwa mä tensión de pulverización 3,5 kV, mä temperatura capilar 250 °C, mä flujo de aire de vaina 60 AU (unidades arbitrarias), ukhamaraki mä flujo de aire auxiliar 20 AU. 250°C ukharu. S ukax 60 AU ukjaruw uñt’ayasi.
Análisis de cromatografía aniónica-MS ukjamaraki ácidos orgánicos etiquetados 13C ukanakampi. Jilt’iri precipitado metabolito (55μl) ukxa sistema de cromatografía iones Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ukampiwa uñakipata, ukaxa espectrómetro de masas QE-HF (Thermo Fisher Scientific) ukampiwa uñakipata. Mä juk’a arumpixa, 5μl ukjamaraki extracto metabolito ukjamaraki columna Dionex IonPac AS11-HC ukjamaraki HPLC (2 mm×250 mm, tamaño de partículas 4μm, Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki modo de bucle parcial push-in ukjamaraki ratio de relleno 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC ukaxa mä columna de guardia (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki. Aka columna uksanxa 30 °C ukjamawa, ukatxa automuestreador ukaxa 6°C ukjamawa. Mä cartucho de hidróxido de potasio ukampiwa uma desionizada ukampiwa churataraki, ukhamata gradiente de hidróxido de potasio ukaxa generador de eluyente tuqi lurañataki. Aka metabolitos ukjamaraki caudal 380μl/min ukjamaraki aka gradiente ukjamaraki: 0 a 3 minutos, 10 mM KOH; 3 ukatxa 12 minutos, 10 ukatxa 50 mM KOH; 12 ukatxa 19 minutos, 50 ukatxa 100 mM KOH; 19 ukatxa 21 minutos , 100 mM KOH; 21 ukatxa 21,5 minutos, 100 ukatxa 10 mM KOH. Aka columna ukaxa mayampi equilibrada 10 mM KOH ukjamaraki 8,5 minutos ukjamawa.
Aka metabolitos eluidos ukaxa mayachatarakiwa mä corriente de suplemento de isopropanol 150μl/min ukjamaraki columna ukxaruxa dirigidas a un espectrómetro de masas de alta resolución operando en modo de ionización negativa. MS ukaxa uñjiwa masa m/z 50 ukatxa 750 ukjakama mä resolución 60.000. AGC ukaxa 1×106 ukjamawa, ukatxa iones ukjamaraki 100 ms ukjamawa. Aka ESI junt’u umaxa mä voltaje de pulverización 3,5 kV ukjamawa. Yaqha configuración ukaxa iones uksa tuqita akhamawa: temperatura capilar 275°C; vaina gas flujo, 60 AU; flujo auxiliar de gas, 20 AU a 300°C, ukatxa lente S ukaxa 60 AU ukjamawa.
Aka yatxatawixa metabolitos etiquetados 13C ukjamaraki. Software TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) ukampixa isótopos ukanaka uñakipañatakixa yatxatatawa. Sapa compuesto ukan identidad ukax mä compuesto de referencia confiable ukamp chiqanchatawa ukatx independientemente uñakipatarakiw. Aka análisis de enriquecimiento isótopos lurañatakixa, área de cromatograma de iones extraídos (XIC) sapa isótopo 13C (Mn) uksatxa apsutarakiwa [M + H] + uksatxa, kawkhantixa n ukaxa carbono jakhüwiwa aka compuesto diana uksa tuqita, ukaxa aminoácidos uksa tuqita uñakipañataki jan ukaxa [ MH] + uksa tuqita apsutarakiwa aniones uksa tuqita. XIC ukan masa exactitud ukax phisqa partes por millón ukjat juk’ampiwa, ukatx RT ukan exactitud ukax 0,05 minutos ukjawa. Aka análisis de enriquecimiento ukaxa lurasirakiwa sapa isótopo uñakipata sapa isótopos ukanakampi suma taqpacha isótopos ukanakampi aka compuesto correspondiente ukanakampi. Aka ratios ukaxa sapa isótopo ukjamaraki sapa patakata uñakipata, ukatxa aka lurawixa uñacht’ayatarakiwa enriquecimiento porcentual molar (MPE), kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata (42).
Aka pellet de neuronas congeladas ukaxa homogeneizada ukhamawa hielo-frío 80% metanol (v/v), vortex ukjamaraki incubado -20 °C 30 minutos. Aka muestra ukxa mayampi vortex ukampiwa ch’axtuña ukatxa +4°C ukjamaru 30 t’ijturjama ch’axtuña. Aka muestra ukxa centrifugada 21.000 g 5 minutos a 4 °C, ukxaruxa apsutarakiwa sobrenadante ukjamaraki wañt’ayatarakiwa concentrador SpeedVac 25 °C ukjamaru qhiparu uñakipañataki. Kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata, análisis LC-MS ukaxa luratarakiwa aminoácidos ukanakampi aka celulas clasificadas ukanakampi. TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) ukampiwa lurataraki, sapa compuesto ukana masa monoisótópica ukampiwa análisis de datos ukaxa lurataraki. Normalización cuantil de datos metabolitos ukaxa luratarakiwa aka paquete de software preprocessCore (57) ukampiwa.
Slice wakicht’aña. Uka ch’uqixa jank’akiw dióxido de carbono ukampiwa anestesia ukjamaraki p’iqip ch’uqt’ataraki, p’iqixa jank’akirakiw p’iqit apsutaraki, ukatxa hielompi phuqt’ata cuchillo vibrante (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) ukampiwa khuchhurata 300 a 375 μm secciones sagitales ukanakaru Gasificación de carbono frío (95% O2 y 5% CO2) Pisi Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 ukatxa 6,0 mM MgCl2 Ajustar a pH 7,4 y 310 a 330 mOsm). Aka apsutanakaxa p’iqi ch’uqitxa apsutarakiwa mä cámara ukanxa jilpacha Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 4,0 mM CaCl2 ukhamaraki mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 ukhamaraki 310 ukatxa 320 mOsm). Uka rebanadas ukanakaxa 20 jan ukaxa 30 minutos ukjamawa imaña, ukhamata janïra grabaciona tukuykasaxa mayampi sumaptañapataki.
grabaciona luraña. Taqi grabacionanakatakixa mä etapa microscopio ukanxa cámara de grabación fija ukampi ukhamaraki lente objetivo de inmersión a agua 20x (Scientifica) ukampiwa lurataraki. Aka putativas células Purkinje ukaxa uñt’atarakiwa (i) tama cuerpo, (ii) ubicación anatómica del cerebelo, ukhamaraki (iii) expresión del gen reportero mtYFP fluorescente. Aka pipeta de parche ukaxa mä resistencia punta 5 a 11 megohms ukjamawa apsutaraki mä capilar de vidrio borosilicato (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) ukhamaraki mä pipeta horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Taqi grabacionanakaxa amplificador de abrazadera de parche npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Alemania) ukampiwa lurataraki, ukaxa software Signal (versión 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Reino Unido) ukampiwa lurataraki. Uka yant’awixa 12,5 kHz ukja muestreo ukanwa qillqt’ataraki. Señal ukaxa pä filtros de paso corto Bessel ukanakampiwa filtrata, ukaxa frecuencias de corte 1,3 ukhamaraki 10 kHz ukjamawa. Aka capacitancia membrana ukatxa pipeta ukaxa compensada ukhamawa circuito de compensación ukampi amplificador ukampi. Taqi yant’awinakaxa luratarakiwa mä cámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemania) ukana apnaqata, ukaxa software Hokawo (versión 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania) ukampiwa lurataraki.
Configuración rutinaria de células enteras ukatxa uñakipaña. Jank’aki janïra grabación lurañatakixa, pipeta ukxa manqhana solución ukampiwa phuqhantayataraki, ukaxa aka sustancias ukanakampiwa: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconato de potasio, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosina trifosfato (GTP) (Na) ukhamaraki Aka fosfato de creatinina 10,0 mM ukjamaraki pH 7,25 ukjamaraki presión osmótica ukjamaraki 290 mOsm (sacarosa) ukjamaraki. Ukhamaraki, 0 pA ukjam ch’amampiwa membrana uksa tuqiru ch’amanchata, ukatxa potencial de membrana de descanso uksa tuqita yatxatatarakiwa. Aka resistencia de entrada ukaxa uñakipatawa corrientes hiperpolarizadas ukanakampi -40, -30, -20, ukhamaraki -10 pA ukanakampi. Uka voltaje ukaxa kunjamasa ukxa tupuña ukatxa Ohm kamachimpiwa resistencia de entrada uka jakhthapiña. Actividad espontánea ukaxa qillqt’atarakiwa mä abrazadera de tensión ukanxa 5 minutos ukjamawa, ukatxa sPSC ukaxa uñt’atarakiwa ukhamaraki tuputaraki Igor Pro (versión 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, EE.UU.) ukanxa mä script de reconocimiento semiautomático ukampiwa. Curva IV ukatxa corriente de estado estacionario ukaxa pila ukxa kunaymana potenciales ukanakana abrazadera ukampiwa tuputaraki (-110 mV ukjata qalltasina) ukhamaraki voltaje ukaxa 5 mV ukjaruwa jilxatayataraki. AP lurawixa yant’atarakiw mä corriente despolarizante ukampiwa. Aka celulaxa -70 mV ukjamawa abrazadera ukjamaraki pulso de corriente despolarizante ukjamaraki. Sapa unidad de grabación ukana paso tamapaxa sapa mayniru (10 a 60 pA) chiqanchañawa. Jakhuña AP frecuencia máxima ukaxa manualmente jakthapiwa pulso picos ukaxa jilpacha frecuencia AP ukaru puriyi. Umbral AP ukaxa uñakipatawa payïri derivado ukampi pulso de despolarización ukampi ukaxa nayraqata mä jan ukaxa walja APs ukanaka ch’amancharaki.
Configuración de parches perforados ukatxa análisis ukampi. Grabación de parches perforados ukaxa protocolos estándar ukanakampiwa luraña. Mä pipeta janïra ATP ukhamaraki GTP ukampi luratarakiwa, ukaxa janiwa aka yänakampixa utjkiti: 128 mM gluconato K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA ukatxa 2 mM MgCl2, ukatxa pH 7,2 ukjamaru chiqanchatarakiwa (KOH apnaqasa). ATP ukatxa GTP ukaxa apsutarakiwa solución intracelular uksatxa, ukhamata jani permeabilidad jan controlada membrana celular uksa tuqita. Aka pipeta de parche ukaxa phuqt’ayatarakiwa mä solución interna anfotericina ukampi (niya 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ukhamata mä registro de parche perforada uka apsuñataki. Aka anfotericina ukjamaraki sulfóxido de dimetil ukjamaraki (concentración final: 0,1 a 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Uka concentración de DMSO apnaqata ukaxa janiwa mä jach’a efectos uñacht’aykiti neuronas yatxatatanakaruxa. Aka punchu lurawi taypinxa, resistencia de canal (Ra) ukaxa sapa kutiwa uñjasiraki, ukatxa yant’awixa qalltatarakiwa amplitud de Ra ukhamaraki AP estabilizada (20-40 minutos). Actividad espontánea ukaxa mä abrazadera de tensión ukhamaraki/jan ukaxa corriente ukanakampiwa 2 a 5 minutos ukjama uñakipata. Uka yatxatawi thakhinchawixa Igor Pro (versión 7.05.2, WaveMetrics, EE.UU.), Excel (versión 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EE.UU.) ukhamaraki GraphPad Prism (versión 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ukanakampiwa lurataraki. Estados Unidos markanxa). APs espontáneos ukanakar uñt’ayañatakix IgorPro ukan NeuroMatic v3.0c plugin ukampiw apnaqasi. Automáticamente APs uñt’ayaña mä umbral uñt’ayata, ukaxa sapa mayniru sapa registro ukata chiqanchatawa. Uka intervalo de pico ukampixa, frecuencia de pico ukaxa mä máxima frecuencia de pico instantánea ukampi ukhamaraki frecuencia de pico promedio ukampi.
PN ukax yaqhawjar jaqukipatawa. Aka protocolo nayraqata uñt’ayata ukarjama adaptación ukampixa, PNs ukaxa puriyatarakiwa cerebelo de rata uksatxa mä etapa especificada ukanxa (58). Mä juk’a arumpixa, cerebelo ukxa diseccionata ukhamaraki picado en medio de disociación hielo frío [janiwa HBSS Ca2+ ukatxa Mg2+ ukampi, yapxatatarakiwa 20 mM glucosa, penicilina (50 U/ml) ukhamaraki estreptomicina (0,05 mg/ ml)], ukxaruxa digerir el medio en papaína [HBSS, suplementado con 1-cisteína·HCl (1 mg / ml), papaína (16 U / ml) ukhamaraki desoxirribonucleasa I (ADNasa I; 0,1 mg/ml)] ukjamaraki 30 minutos ukjamawa 30 °C ukjamaru. Nayraqata jariqañawa tejidos ukanakaxa medio HBSS ukanxa mucosidad de huevo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ukhamaraki DNasa (0,1 mg/ml) ukanakampi temperatura ambiente ukanxa jani digestión enzimática ukampi, ukxaruxa medio HBSS ukanxa 20 mM glucosa ukampiwa Llamp’u chuymampi muyuña HBSS, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) ukhamaraki ADNasa (0,1 mg/ml) ukaxa sapa celulanakaruwa mistu. Aka suspensión celular ukjamaraki filtrada ukjamaraki colador celular 70μm ukjamaraki, ukxaruxa celulanakaxa pelletadas ukjamaraki centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) ukjamaraki resuspendida en medio de clasificación [HBSS, suplementado con glucosa 20 mM, 20% bovino fetal ) Suero, penicilina (50 U/ml) ukhamaraki estreptomicina (0,05 mg/ml)] ukjamaraki; ukhamaraki viabilidad celular yoduro de propidio ukampi chikachasiña ukhamaraki densidad celular 1×106 a 2×106 células/ml ukjamaru chiqanchaña. Janïra citometría de flujo lurañatakixa, suspensión ukaxa filtrada ukhamawa mä colador celular 50 μm ukjamaru.
Citometro de flujo ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. Aka celula uñakipañatakixa luratarakiwa 4 °C ukjamaraki maquina FACSAria III (BD Biosciences) ukhamaraki software FACSDiva (BD Biosciences, versión 8.0.1) ukanakampi. Aka suspensión celular ukjamaraki boquilla 100 μm ukjamaraki presión 20 psi ukjamaraki ~2800 eventos/seg. Niyakixay criterios tradicionales de gating (tamaño de células, discriminación bimodal, ukhamaraki características de dispersión) ukaxa janiwa asegurar la aislamiento correcto de PN de otros tipos de células, aka estrategia de gating ukaxa utt’ayatarakiwa directa comparación de la intensidad YFP ukhamaraki autofluorescencia mitoYFP+ ​​ukhamaraki control mitoYFP − Ratones. YFP ukaxa wali ch’amanchatawa irradiación de la muestra ukampi línea láser 488 nm ukampi, ukatxa señal ukaxa uñt’atarakiwa filtro de paso de banda 530/30 nm ukampi. Ukhamaraki, mitoYFP+ ​​ch’uqitxa, aka gen yatiyiri Rosa26-mitoYFP ukaxa wali ch’amampiwa lurataraki, ukhamata cuerpo neuronal ukhamaraki fragmentos axónicos ukanaka yaqhachañataki. 7-AAD ukaxa 561 nm q’illu láser ukampiwa ch’amanchataraki ukatxa 675/20 nm filtro de paso de banda ukampiwa uñakipata, ukhamata jiwata celulanaka jani apsuñataki. Aka pachpa pachana astrocitos ukanaka jaljañatakixa, suspensión celular ukaxa ACSA-2-APC ukampiwa tintayataraki, ukxaruxa muestra ukaxa irradiada línea láser 640 nm ukampiwa, ukatxa filtro de paso de banda 660/20 nm ukampiwa señal uñt’ayataraki.
Aka apthapita celulanakaxa pelletizado ukhamawa centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) ukjamaraki -80 °C ukjamaru imatarakiwa apnaqañkama. Mfn2cKO ch’uqimpi ukhamaraki litter pups ukanakampixa pachpa uruwa clasificataraki ukhamata variabilidad procedimental jisk’achañataki. FACS ukan yatxatawi uñacht’ayawipa ukhamaraki uñakipaña software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, EE.UU.) ukampiwa lurataraki.
Kunjamatixa nayraqata arsuwayktanxa (59), PCR chiqapa pachana apnaqatarakiwa ADN uksa tuqita apsuñataki aka neuronas clasificadas ukatxa qhiparu cuantificación de ADNmt ukataki. Aka linealidad ukhamaraki sensibilidad umbral ukaxa qalltanxa yant’atarakiwa qPCR ukampiwa kunaymana jakhunaka celulanakaru. Mä juk’a arumpixa, apthapitawa 300 PN mä tampón de lisis ukjamaraki 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 ukhamaraki proteinasa K (200 ng/ml) ukjamaraki incubar 55 °C 120 minutos. Aka celulanakaxa juk’ampi incubadas 95 °C 10 minutos ukjamaraki inactivación completa de la proteinasa K. Aka sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica mt-Nd1 ukjamaraki ADNmt ukjamaraki PCR semicuantitativa ukjamaraki sistema 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki. Ciencia, catálogo número Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, catálogo número AIVI3E8) ukhamaraki 18S (Thermo Fisher Scientific, catálogo número Hs99999901_s1) ukanakampi.
Proteoma muestra wakicht’aña. Aka solución ukxa 95 °C ukjamaru 10 minutos ukjamaru junt’uchaña ukhamaraki sonicado, aka tampón de lisis [cloruro de guanidina 6 M, clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina 10 mM, cloroacetamida 10 mM ukhamaraki pellets neuronas congelados tris- Lisa 100 mM HCl uksana]. Bioruptor (Diagenode) ukampi 10 minutos (30 segundos pulso / 30 segundos periodo de pausa). Aka muestra ukxa 1:10 ukjamawa diluida 20 mM tris-HCl (pH 8,0), ukjamaraki 300 ng de oro de tripsina (Promega) ukjamaraki incubadas mä aruma 37 °C ukjamaru taqpacha digestión ukaru puriñapataki. Payïri uruxa, muestra ukaxa centrifugada 20.000 g 20 minutos ukjamawa. Aka sobrenadante ukxa diluida 0,1% ácido fórmico ukampiwa, ukatxa solución ukxa desalida ukjamaraki autohecho StageTips ukampiwa. Aka muestra ukxa wañt’ayatarakiwa mä instrumento SpeedVac (concentrador de Eppendorf más 5305) ukjamaraki 45 °C ukjamaru, ukxaruxa péptido ukxa suspendirakiwa ácido fórmico 0,1% ukjamaru. Taqi muestras ukanakaxa pachpa jaqina mä pachanwa wakicht’ata. Aka muestras de astrocitos ukanaka uñakipañatakixa, 4 μg de péptidos desalidos ukanakaxa etiquetadas ukhamaraki etiqueta de masa tándem (TMT10plex, número de catálogo 90110, Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki 1:20 ukjamawa. Etiquetado TMT uksa tuqiruxa, 0,8 mg de reactivo TMT ukjamaraki 70 μl de ACN anhidro ukjamaraki reconstituido ukjamaraki 9 μl de 0,1 M TEAB (bicarbonato de trietilamonio), ukjamaraki 7 μl de reactivo TMT ACN ukjamaraki. Ukasti 43,75% ukjawa. Aka 60 minutos ukjamaraki reacción ukjamaraki 2 μl de hidroxilamina 5% ukjamaraki. Aka péptidos etiquetados ukxa apthapitawa, wañt’ayatarakiwa, resuspendida 200μl de ácido fórmico 0,1% (FA), pä tuqiru jaljatarakiwa, ukxaruxa desaltatarakiwa autohecho StageTips ukampiwa. Aka UltiMate 3000 ultra alto rendimiento cromatógrafo líquido (UltiMate 3000 ultra alto rendimiento líquido cromatografía), mä pä chikata fraccionada mä columna cromatográfica Acquity 1mm x 150mm ukjamaraki 130Å1.7μm C18 partículas (Waters, catálogo No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Cientifico ukat juk’ampinaka). Péptidos ukjamaraki caudal 30μl/min ukjamaraki 1% ukjamaraki 50% tampón B ukjamaraki 85 minutos ukjamaraki gradiente paso a paso 96 minutos ukjamaraki 50% ukjamaraki 95% tampón B ukjamaraki 3 minutos ukjamaraki 8 minutos ukjamaraki 95 % Tampón B ukjamaraki; Tampón A ukaxa 5% ACN ukjamaraki 10 mM bicarbonato de amonio (ABC) ukjamaraki tampón B ukjamaraki 80% ACN ukjamaraki 10 mM ABC ukjamaraki. Sapa 3 t’ijturjamawa fracciones apthapita ukatxa pä quturu (1 + 17, 2 + 18, juk’ampinaka) mayachaña ukatxa centrífuga de vacío ukanwa wañt’ayaña.
LC-MS/MS uñakipaña. Aka espectrometría de masas ukjamaraki, péptidos (número r119.aq) ukjamaraki 25 cm, 75 μm diámetro interno columna analítica PicoFrit (machaq lente objetivo, parte número PF7508250) ukjamaraki equipada 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medio (Dr. Maisch, mat), EASY-nLC ukampi 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemania markankir jaqinaka). Uka columna ukaxa 50 °C ukjamawa. Tampón A ukhamaraki B ukjamaraki 0,1% ácido fórmico umampi ukhamaraki 0,1% ácido fórmico 80% ACN ukjamaraki. Péptidos ukjamaraki gradiente a paso 200 nl/min ukjamaraki 6% ukjamaraki 31% tampón B ukjamaraki 65 minutos ukjamaraki 31% ukjamaraki 50% tampón B ukjamaraki 5 minutos ukjamaraki. Aka péptidos eluidos ukanakaxa espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) ukampiwa uñakipata. Aka precursor de péptido m/z uksa tupuxa luratarakiwa mä resolución 120.000 ukjamaraki 350 ukhamaraki 1500 m/z ukjama. Aka 27% ukja energía de colisión normalizada ukampi apnaqasa, ch’amani precursor ukaxa estado de carga 2 ukatxa 6 ukjaruwa ajllitaraki jach’a energía C trampa disociación (HCD) uksa tuqita escisión ukataki. Uka ciclo pachaxa 1 s ukjawa. Aka fragmento péptido ukjamaraki m/z ukjamaraki trampa de iones ukjamaraki jisk’a diana AGC 5×104 ukjamaraki máxima tiempo de inyección 86 ms ukjamaraki. Fragmentación ukxaruxa, precursor ukaxa lista de exclusión dinámica uksaruwa 45 s ukjamaru uchataraki. Aka péptidos marcados TMT ukjamaraki 50 cm, 75 μm ukjamawa mä columna Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, catálogo número 164942) ukjamaraki espectros de migración ukjamaraki espectrómetro de masas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki equipos de iones de forma de ondas asimétricas de alto campo (FAIMS) ukanakampi (Thermo Fisher Scientific) ukaxa pä voltajes de compensación −50 ukhamaraki −70 V. MS3 ajllitaxa precursor de sincronización ukarjamaxa apnaqatarakiwa TMT yatiyawi iones señal medición ukataki. Aka separación de péptidos ukjamaraki EASY-nLC 1200 ukjamaraki elución gradiente lineal 90% ukjamaraki concentración de tampón 6% ukjamaraki 31% ukjamaraki; tampón A ukjamaraki 0,1% FA ukjamaraki tampón B ukjamaraki 0,1% FA ukjamaraki 80% ACN ukjamaraki. Aka columna analítica ukaxa 50°C ukjamawa. FreeStyle (versión 1.6, Thermo Fisher Scientific) ukampiwa archivo original ukaxa FAIMS voltaje de compensación ukarjama jaljañataki.
Proteínas ukanaka uñt’aña ukhamaraki cuantificación ukanaka. Andromeda thakhi mayachata apnaqasa, nayrïr yatxatawinakax MaxQuant versión 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ukampiw uñakipata. Ukhamaraki, Cre recombinasa ukatxa YFP secuencias ukanakaxa Aequorea victoria uksatxa apsutarakiwa, espectros de fragmentos péptidos ukanakaxa thaqhatarakiwa secuencia canónica ukhamaraki secuencia isoforma ukatxa proteoma de referencia de rata (Proteoma ID UP000000589, UniProt uksatxa mayo phaxsina 2017 marana apsutarakiwa) . Oxidación de metionina ukatxa acetilación proteica N-terminal ukaxa modificaciones variables ukhamjamawa utt’ayataraki; metilación carbamoilo de cisteína ukaxa modificaciones fijas ukhamjamawa utt’ayataraki. Aka parámetros de digestión ukaxa “especificidad” ukhamaraki “tripsina/P” ukjamawa. Aka jisk’a jakhuwi péptidos ukhamaraki péptidos de navajas ukanakaxa identificación proteica ukatakixa 1; ukatxa jisk’a jakhuxa sapa mayni péptidos ukaxa 0. Aka condiciones de mapa de péptidos ukanakampi chikachasiñatakixa, tasa de identificación proteica ukaxa 0,01 ukjawa. “Payïri Péptido” ukaxa ch’amanchatawa. “Match between runs” uka amtawimpiw kunayman original archivonak taypin suma uñt’ayasiñanak mayjt’ayañataki. Ukaxa LFQ mínimo ratio 1 ukampi luratarakiwa cuantificación sin etiqueta (LFQ) (60). Aka LFQ intensidad ukaxa filtrada ukhamawa pä valores validos ukanakampi mä grupo genotipo ukanxa sapa pachana, ukatxa extrapolada ukhamawa mä distribución normal ukata mä ancho de. 0.3 ukatxa 1.8 ukjaruwa saraña. Plataforma de computación Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ukat R (https://r-project.org/) ukanakamp LFQ ukan yatxatäwinakap uñakipañataki. Mä pä thakhi moderado t yant’awixa software limma ukatxa apnaqatarakiwa análisis de expresión diferencial (61). Uka yatxatawi yatxatawi thakhixa ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ukatxa pheatmap ukanakampiwa lurataraki. Aka proteómica TMT ukanxa uñakipatawa MaxQuant versión 1.6.10.43 ukampiwa. Proteómica cruda ukan yatiyawinakap thaqhañatakix UniProt ukan jaqinakan proteómica ukan yatiyawinakap thaqhapxi, ukax septiembre phaxsin 2018 maranw apkatata, uka uñakipäwix factor de corrección de pureza de isótopos ukan luratawa, ukax fabricante ukan churatawa. R uksanx limma ukax análisis de expresión diferencial ukatakiw apnaqasi. Nayra yatiyawi, base de datos ukan thakhinchawipa, ukhamaraki datos uñakipaña lurawi ukhamaraki lurawixa taqpachawa imatäxi alianza ProteomeXchange ukanxa PRIDE socio ukan imaña utapa tuqi identificador de conjunto de datos PXD019690 ukampi.
Anotaciones funcionales ukax análisis ukaruw qamiriptayi. Aka herramienta de Análisis de Ruta de Ingenio (QIAGEN) ukampixa 8 semanas ukjata uñakipatawa términos de anotación funcional ukanakana riqueza uñakipañataki (Figure 1). Mä juk’a arumpixa, lista cuantitativa proteica ukaxa apsutarakiwa análisis de datos LC-MS/MS (espectrometría de masas tándem) ukjamaraki aka criterios de filtración ukanakampi: Mus musculus ukaxa ajllitawa especie ukhamaraki fondo ukjamaraki, ukatxa categoría ukaxa uñacht’ayiwa valor P ajustado Benjamini ukjamaraki enriquecimiento 0,05 ukjamaraki juk’ampi suma uñjata. Aka gráfico ukatakixa, sapa clúster ukanxa phisqa jach a exceso categorías ukanakawa P valor ajustado ukarjama uñacht ayata. Walja t-test ukampiwa, programa de impulso lineal de dos etapa Benjamini, Krieger, Yekutieli (Q = 5%) ukampiwa lurataraki, análisis de expresión proteica de curso de tiempo ukaxa luratarakiwa wakiskir candidatos ukanakaru sapa categoría ukana uñt’atanakaru, ukatxa sapa filaxa sapa mayniwa uñakipata. Janiw mä SD constante ukar apsuñax wakiskiti.
Aka yatxatawi lurawixa bases de datos publicadas ukanakampi chikachasiñataki ukhamaraki mä diagrama Venn lurañataki 1 uñacht’awina, lista cuantitativa proteica ukampi anotaciones MitoCarta 2.0 (24) ukampiwa mayachataraki. Uka diagrama lurañatakix herramienta en línea Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ukampiw apnaqasi.
Uka suma yatxatañatakixa aka procedimientos estadísticos ukanakaxa análisis proteómico ukatakixa apnaqatarakiwa, ukaxa uñakipt’atarakiwa aka sección correspondiente de Materiales y Métodos. Taqi yaqha yant’awinakatakixa, suma yatiyawixa uka leyenda correspondiente ukanwa jikxatasi. Jani yaqha tuqita qhananchata, taqi yatxatawixa promedio ± SEM ukjamawa uñacht ayata, ukatxa taqi análisis estadístico ukaxa software GraphPad Prism 8.1.2 ukampiwa lurataraki.
Aka qillqatan materiales suplementarios ukanakatakix http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ukar mantasma
Akax mä qillqat jist’arat uñt’ayawiwa, ukax Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ukan kamachinakaparjamaw jaljasi, ukax kuna medios ukan apnaqañapataki, jaljañapataki ukhamarak uñstayañapatakiw jayti, kunapachatix qhipa apnaqañax jan comercial ganancia ukat premisa ukax nayrïr lurawix chiqaw sañ muni. Yaqha.
Qhanacht’awi: Correo electrónico ukar uñt’ayañakiw mayipxsma, ukhamat khititix página ukar iwxt’kta ukax yatiñapataki, jupanakax correo electrónico ukar uñjañ munapxta ukat janiw spam ukhamäkiti. Jiwasax janiw kuna correo electrónico ukanakas katjañäniti.
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Ukhamaraki, E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson jilatajj ukhamänwa
Análisis proteómico de neuronas disfuncionales ukaxa uñacht’ayiwa programas metabólicos ukaxa activados ukhamawa neurodegeneración ukaru saykatañataki.
Ukhamaraki, E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson jilatajj ukhamänwa
Análisis proteómico de neuronas disfuncionales ukaxa uñacht’ayiwa programas metabólicos ukaxa activados ukhamawa neurodegeneración ukaru saykatañataki.
©2020 Asociación Americana para el Adelanto de la Ciencia uka tuqita. taqi derechos ukanakaxa jark’atawa. AAAS ukax HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ukat COUNTER ukanakan yanapiripawa. CienciaAvances ukax ISSN 2375-2548 ukaruw uñt’ayasi.