Aka qillqataxa “Legumbres ukanakana patógenos ukatxa plagas ukanakaru saykatañapataki” yatxataña tuqita chiqapawa, taqpacha 5 qillqatanaka uñakipt’aña
Aka agente causal de la necrosis de enfermedad de plantas hongos Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ukaxa mä estrategia multinivel ukampiwa kunaymana huésped quqanakaru usuchjañataki. Aka yatxatawixa diamina L-ornitina, mä aminoácido no proteico ukaxa yaqha aminoácidos esenciales ukanakana síntesis uksa ch’amancharaki, mä estrategia de gestión alternativa ukhama Phaseolus vulgaris L. uksa tuqita ch’amanchañataki respuestas moleculares, fisiológicas ukhamaraki bioquímicas uksa tuqita janq’u moho uksa tuqita, ukaxa Pseudomonas sclerotiorum uksa tuqita. Aka yant’awinakaxa in vitro uksanxa uñacht’ayiwa L-ornitina ukaxa wali jark’aqiriwa S. pyrenoidosa uksa tuqita micelio uksa tuqita mä dosis tuqita. Ukhamaraki, invernadero ukanx janq’u moho ukan jan walt’awinakaparux wali jisk’achaspawa. Ukhamaraki, L-ornitina ukaxa qullata ayrunakaru jiltañatakixa ch’amancharaki, ukaxa uñacht’ayiwa yant’ata concentraciones de L-ornitina ukaxa janiwa fitotóxicas ukhamäkiti qullata quqanakaru. Ukhamaraki, L-ornitina ukaxa ch’amancharaki expresión de antioxidantes no enzimáticos (fenólicos solubles totales y flavonoides) ukhamaraki antioxidantes enzimáticos (catalasa (CAT), peroxidasa (POX), ukhamaraki polifenol oxidasa (PPO)), ukhamaraki jilxatarakiwa expresión de genéticos relacionados con tres antioxidantes (PvCAT1, PvSOD, y PvGR). Ukhamaraki, análisis in silico uksanxa uñacht’ayatarakiwa mä proteína putativa oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) ukjamaraki genoma S. sclerotiorum uksanxa, ukaxa wali uñtasitawa aka proteínas de oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) ukhamaraki Penicillium sp. (PlOAH) ukax análisis funcional, dominios conservados ukat topología ukanakat uñakipatawa. Ukasti, L-ornitina ukjamaraki medio de caldo de dextrosa de papa (PDB) ukjamaraki expresión de gen SsOAH ukjamaraki S. sclerotiorum micelia uksanxa wali jisk’achatarakiwa. Ukhamaraki, aplicación exógena de L-ornitina ukaxa wali jisk’acharaki expresión gen SsOAH ukjamaraki micelios hongos apthapita tratados ayrunakata. Tukuyañatakixa, L-ornitina ukjamaraki apsutaxa wali jisk’acharaki secreción de ácido oxálico ukjamaraki medio PDB ukhamaraki infectado laphinakanxa. Tukuyañatakixa, L-ornitina ukaxa mä jach’a lurawiwa estado redox ukaru uñjañataki ukhamaraki ch’amanchañataki defensa respuesta infectadas quqanakaru. Aka yatxatawi lurawixa yanapt’aspawa machaq thakhinaka lurañataki, pachamamaru yanqhachañataki janq’u moho ukaru jark’aqañataki ukhamaraki jani walt’awinakaxa jawasa lurañataki ukhamaraki yaqha juyranakaru jani walt’ayañataki.
Janq’u moho, ukaxa luratarakiwa hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ukaxa mä jan walt’ayiriwa, ukaxa mä jach’a jan walt’awiwa aka uraqpachana habas (Phaseolus vulgaris L.) lurañataki (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum ukaxa mä ch’amawa uraqi tuqita apaqata hongos ayrunaka patógenos ukanakatxa controlañataki, ukaxa mä jach’a huésped ukaniwa 600 jila especies de plantas ukatxa jank’aki macerar tejidos huésped ukanakaru mä jan específico ukhama (Liang y Rollins, 2018). Jan wali pachanakanxa, mä fase crítica de ciclo de vida uksanxa, jaya pachanakawa ikiña qhipararaki ch’iyara, ch’ama, jatha uñtasita estructuras sata ‘esclerotia’ uraqina jan ukaxa janq’u, muxsa jiltawi ukhama micelio jan ukaxa tronco pith infectadas sata quqanakana (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum ukaxa esclerotia uñstayañatakixa wali ch’amawa, ukaxa usuchjata yapunakanxa jaya pachanakawa jakañataki ukhamaraki usunakaxa utjaskakiwa (Schwartz et al., 2005). Esclerotia ukaxa wali suma manq’aña yänakampi, uraqina jaya pachanakawa utjañapa, ukatxa qhipa infecciones ukanakatakixa inóculo primario ukhamawa (Schwartz et al., 2005). Suma pachanakanxa, esclerotios ukaxa ch’uxñaruwa tuku ukatxa aire transbordo esporas ukanakawa lurasi, ukaxa taqi uraqi pata tuqina quqaruxa usuchjarakispawa, ukhamaraki panqaranakaru, ch’akhanakaru, jan ukaxa vainas ukanakaru (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum ukaxa mä estrategia multinivel ukampiwa apnaqi, ukaxa anfitrión quqanakaru usuchjañatakixa, ukaxa mä serie de eventos coordinados ukanakampiwa lurataraki, ukaxa germinación esclerotial ukatxa sintoma uñstayañkama. Qalltanxa, S. sclerotiorum ukaxa esporas suspendidas (ascosporas sata) uñstayi, ukaxa ch’uqi uñtasita estructuras ukanakatxa apothecia sata, ukaxa aire ukarjamawa tukuraki ukatxa esclerocias no móviles ukarjamawa jilxati infectadas de residuos de plantas ukanakaru (Bolton et al., 2006). Ukxarusti aka hongo ukaxa ácido oxálico, mä factor de virulencia, ukaxa controla pH de la pared celular de plantas, ukhamaraki degradación enzimática ukhamaraki invasión tisular ukanaka ch’amanchañataki (Hegedus y Rimmer, 2005), ukhamaraki suprimir la ráfaga oxidativa de la planta huésped. Aka proceso de acidificación ukaxa ayrunaka celula pirqaru jan ch’amancharaki, ukaxa mä suma pacha churaraki normal ukhamaraki eficiente operación de enzimas degradantes de la pared de células hongos (CWDEs), ukhamata patógeno ukaxa barrera física ukaru atipt’añataki ukhamaraki tejidos huésped ukanakaru mantañataki (Marciano et al., 1983). Mä kuti mantasaxa, S. sclerotiorum ukaxa mä qawqha CWDEs ukanakawa mistu, kunjamatixa poligalacturonasa ukatxa celulosa, ukaxa ch’amancharaki ch’iqiyañataki infectados tejidos ukanakaru ukhamaraki necrosis tisular ukanakaru puriyañataki. Uka progresión de lesiones ukatxa esteras hifales ukaxa puriyarakiwa síntomas características de moho blanco (Hegedus y Rimmer, 2005). Ukañkamaxa, anfitrión quqanakaxa patrón molecular asociado a patógenos (PAMPs) ukanaka uñt’apxi receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) ukanakampi, ukaxa mä serie de eventos de señalización ukanaka ch’amancharaki, ukaxa qhiparuxa activa respuestas de defensa.
Tunka maranaka usunaka jark’aqañataki ch’amanchatäkchisa, germoplasma resistente ukaxa pist’iwa habas uksanxa, kunjamatixa yaqha comercial juyranakanxa, kunatixa patógeno ukaxa resistencia, sobrevida ukatxa adaptabilidad ukampi. Ukhamarusa, usunaka apnaqañaxa wali ch’amawa ukatxa mä estrategia integrada, multifacética ukawa wakisi, ukaxa mä combinación de prácticas culturales, control biológico, ukhamaraki fungicidas químicos ukanakampi (O’Sullivan et al., 2021). Control químico de moho blanco ukaxa juk’ampi askiwa kunatixa fungicidas ukaxa, kunapachatixa chiqapa ukhamaraki chiqapa pachana uchatäki ukhaxa, wali sumawa uka usuxa jark’aqaspa, janirakiwa infección ukaxa sinti utjkiti, ukatxa janiwa rendimiento ukaxa pist’kaspati. Ukampirusa, sinti apnaqaña ukhamaraki fungicidas ukanakaru sinti atinisiñaxa cepas resistentes de S. sclerotiorum ukanaka uñstayañatakixa puriyaspawa ukatxa jan waliruwa puriyaspa organismos no objetivos ukanakaru, uraqi k’umaranakaru, ukhamaraki umaru suma uñjañataki (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Ukatwa, pachamamaru jan walt’ayir yaqha thakhinak jikxatañax nayrankxi.
Poliaminas (PAs), ukhamaraki putrescina, espermidina, espermina, ukhamaraki cadaverina, ukaxa mä suma alternativas ukhamawa uraqinakata ayrunaka patógenos ukanakaruxa, ukhamarusa taqpacha jan ukaxa mä chikata jisk’acharakispawa fungicidas químicos peligrosos ukanaka apnaqaña (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Jach’a quqanakanxa, PAs ukaxa walja procesos fisiológicos ukanakanwa chikañchasi, ukampisa janiwa ukakikiti, celulanakaxa jaljatawa, diferenciación ukhamaraki respuesta a estrés abiótico ukhamaraki biótico (Killiny y Nehela, 2020). Jupanakax antioxidantes ukham irnaqapxaspaw, especies de oxígeno reactivo (ROS) uksa apsuñatakix yanapt’apxaspawa, homeostasis redox uksa mantener (Nehela y Killiny, 2023), genes relacionados con la defensa (Romero et al., 2018), kunayman metabólicos thakhinak regulañataki (Nehela ukat Killiny, 2023), fitohormonas endógenas uksa modular (Nehela ukat Killiny, 2023) 2019), utt’ayapxiwa resistencia adquirida sistémica (SAR), ukhamaraki regulación de interacciones plantas-patógenos (Nehela y Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Ukhamaraki, mecanismos específicos ukhamaraki roles de PAs ukanakaxa ayrunaka arxatañatakixa mayja mayjawa, ukaxa especies de plantas, patógenos ukatxa condiciones ambientales ukanakata. Aka PA jilpachxa ayrunakanxa biosíntesis ukampi luratarakiwa aka poliamina L-ornitina esencial (Killiny y Nehela, 2020).
L-ornitina ukaxa walja lurawinakaniwa quqa jiltañataki ukhamaraki jilxatañataki. Sañäni, nayra yatxatawinakaxa uñacht’ayiwa arroz (Oryza sativa), ornitina ukaxa nitrógeno reciclaje ukampi (Liu et al., 2018), arroz rendimiento, calidad ukhamaraki aroma (Lu et al., 2020), ukhamaraki respuesta de estrés de agua (Yang et al., 2000) ukampi chikt’atarakispawa. Ukhamaraki, aplicación exógena de L-ornitina ukaxa wali jach’ancharaki tolerancia sequía ukjamaraki remolacha azucarera (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) ukhamaraki alivió la estrés de sal en ch’uñu (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu y Çavuşoǧlu, 2021) ukhamaraki anacardo (Anacardium occidentale) . quqanaka (da Rocha ukat yaqhanakampi, 2012). Aka L-ornitina ukaxa mä rol potencial ukhamawa defensa de estrés abiótico uksanxa inasa ukaxa involucramiento de acumulación de prolina uksa tuqita qullata quqanakanxa. Sañäni, metabolismo de prolina ukampi chikt’ata genes, ukhamaraki ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) ukhamaraki prolina deshidrogenasa (ProDH1 ukatxa ProDH2) ukanakampi, nayraqata yatiyatarakiwa Nicotiana benthamiana ukatxa Arabidopsis thaliana uka cepas jan huésped Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar ukatxa Mysore, 2012 maran uñt’ayata). Maysa tuqitxa, ornitina decarboxilasa de hongos (ODC) ukaxa wakisiwa patógeno uksa tuqita (Singh et al., 2020). Ukhamaraki ODC ukaxa Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via silenciamiento génico inducido por huésped (HIGS) ukaxa wali jach’ancharaki resistencia tomate quqanakaru Fusarium wilt ukaru (Singh et al., 2020). Ukampirusa, aka rol potencial de la aplicación de ornitina exógena ukaxa estrés bióticos ukanakaru uñtasita fitopatógenos ukanakaruxa janiwa suma yatxatatäkiti. Juk’amp askixa, ornitina ukaxa usunakaru saykatañataki ukhamaraki ukampirusa fenómenos bioquímicos ukhamaraki fisiológicos ukanakampixa jilpachxa janiwa yatxatatäkiti.
Aka complejidad de infección S. sclerotiorum ukaxa legumbres uksa tuqita amuyañatakixa wali askiwa estrategias de control eficaces ukanaka lurañataki. Aka yatxatawinxa, amtapxaraktwa uñt’añataki kunatixa diamina L-ornitina ukaxa mä factor clave ukhamawa mecanismos de defensa ukhamaraki resistencia legumbre quqanakaru Sclerotinia sclerotiorum infección ukaru ch’amanchañataki. Jiwasax hipótesis ukaruw puriraktanxa, jan ukasti, infectadas quqanakan arxatäwip ch’amanchañat sipansa, L-ornitina ukax mä jach’a lurawiw estado redox ukax utjañapataki. Jiwasaxa amuyt’tanwa aka potenciales efectos de L-ornitina ukaxa regulación de mecanismos de defensa antioxidante enzimático ukhamaraki no enzimático ukampi ukhamaraki interferencia ukampi factores patogenicidad/virulencia hongos ukampi ukhamaraki proteínas asociadas ukanakampi. Aka doble funcionalidad L-ornitina ukaxa mä candidato prometedor ukhamawa mä estrategia sostenible ukataki janq’u moho ukana jan walt’awinakapata ukhamaraki ch’amanchañataki resistencia de cultivos comunes de legumbres uka ch’amani patógeno hongo ukaru. Jichha yatxatawi lurawixa yanapt’aspawa machaq thakhinaka lurañataki, pachamamaru yanqhachañataki janq’u moho ukaru jark’aqañataki ukhamaraki legumbre lurañataki jani walt’awinaka jani utjañapataki.
Aka yatxatawinxa, mä variedad comercial susceptible de habas común, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ukaxa material experimental ukjamaraki apnaqatarakiwa. K’umara jathanakaxa suma chuymampiwa churataraki Departamento de Investigación de Legumbres, Instituto de Investigación de Cultivos de Campo (FCRI), Centro de Investigación Agrícola (ARC), Egipto. Pä jathaxa yapuchatarakiwa plástico manq’anaka (diámetro interno 35 cm, manqha 50 cm) S. sclerotiorum ukampiwa phuqhata invernadero ukanxa (25 ± 2 °C, humedad relativa 75 ± 1%, 8 h qhana/16 h ch’amaka). 7–10 urunaka sataña tukuyatatxa (DPS), ch’uqixa jisk’achatarakiwa, ukhamata pä ch’uqi ch’uqiki mä kipka jiltawimpi ukhamaraki kimsa taqpacha jach’aptayata laphinakampi sapa manq’añaru jaytañataki. Taqi manq’aña quqanakaxa sapa pä semanana maya kutiwa umampi warantataraki, ukatxa sapa phaxsiwa abono churasiraki, kunjamatixa churata variedad ukatakixa tasa recomendada ukhama.
Aka 500 mg/L ukjamaraki L-ornitinediamina (uñt’atarakiwa (+)-(S)-2,5-ácido diaminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), 50 mg ukjamaraki 100 mL de agua destilada estéril ukjamaraki. Ukxarusti solución de stock ukaxa diluida ukatxa qhipa yant’awinakanxa apnaqatarakiwa. Mä juk’a pacharuxa, suxta serie de concentraciones de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100, y 125 mg/L) ukanakawa yant’ataraki in vitro. Ukhamaraki, uma destilada estéril ukaxa control negativo (Mock) ukjamaraki fungicida comercial “Rizolex-T” 50% polvo humectable (toclofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticidas and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gobernación de Gharbia, Egipto) ukjamaraki control positivo ukjamaraki. Aka fungicida comercial “Rizolex-T” ukjamaraki in vitro ukjamaraki phisqa concentraciones (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L) ukjamaraki.
Muestras de tallos de habas comunes ukatxa vainas uñacht’ayata síntomas típicos de moho blanco (tasa de infestación: 10–30%) apthapitawa granjas comerciales ukanakatxa. Jilapart usuchjat quqa materiales ukanakax especie/variedad (variedad comercial susceptible Giza 3) ukarjam uñt’atäkchisa, yaqhipanakax, juk’ampis local qhathunakat apsutanakax jan uñt’at especies ukanakawa. Aka apthapita infectadas materiales ukaxa nayraqata desinfectadas superficiales ukjamaraki solución de hipoclorito de sodio 0,5% ukjamaraki 3 minutos ukjamawa, ukxaruxa walja kutiwa jariqataraki uma destilada estéril ukampiwa ukatxa wañt’ayatarakiwa papel filtrante estéril ukampiwa, ukhamata jilpacha uma apsuñataki. Ukxarusti infectados órganos ukaxa jisk’a t’aqaru khuchhurata chika taypi tejidos (k’umara ukhamaraki infectada tejidos ukanaka taypina), cultivadas en medio de agar de dextrosa de papa (PDA) ukjamaraki incubadas a 25 ± 2 °C con ciclo 12 h luz/12 h ch’amaka 5 urunaka ukhamata esclerocia uñstayañataki. Ukhamaraki, método de punta micelial ukampixa aislados de hongos ukanakaxa mistura jan ukaxa contaminadas cultivos ukanakatxa q’umachatarakiwa. Aka aislado de hongos purificados ukaxa nayraqata uñt’atarakiwa características morfológicas culturales ukanakampi ukatxa chiqapawa S. sclerotiorum ukjamaraki microscópicos ukanakampi. Tukuyañatakixa, taqpacha aislados purificados ukanakaxa patogenicidad uñakipañatakixa cultivar de habas común susceptible Giza 3 uksanxa yant’atarakiwa, ukhamata postulatos de Koch ukanakampi phuqhañataki.
Ukhamaraki, juk’ampi invasivo S. sclerotiorum aislado (aislado #3) ukaxa juk’ampi chiqanchatarakiwa secuenciación espaciador transcrito interno (ITS) ukjamaraki White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Mä juk’a pacharuxa, aislados ukaxa yapuchatarakiwa caldo de dextrosa de papa (PDB) ukjamaraki incubadas a 25 ± 2 °C 5–7 días. Ukxarusti micelio hongo ukaxa apthapitawa, ukaxa filtrado ukhamawa queso ukata, pä kutiwa jariqataraki uma estéril ukampiwa, ukatxa wañt’ayatarakiwa papel filtrante estéril ukampiwa. ADN genómico ukxa apsutarakiwa Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) ukampiwa. Ukxarusti aka ITS rDNA suyuxa amplificada ukhamaraki específico par de cebadores ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; suyt’ata tama: 540 pb) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Aka q’uma PCR ukjamaraki secuenciación ukjamaraki (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.) ukjamaraki. Aka ITS rDNA secuencias ukaxa secuenciadas bidireccionales ukjamaraki método de secuenciación Sanger ukampiwa lurataraki. Ukatxa tantachata secuencias de consulta ukaxa uñakipatarakiw qhipa yatxatawimpi GenBank ukhamaraki Centro Nacional de Información Biotecnología (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) software BLASTn ukampiwa. Aka jiskt’awi secuencia ukaxa uñakipatarakiw 20 yaqha cepas/aislados de S. sclerotiorum ukanakampi, ukaxa apsutarakiwa qhipa yatiyawinakata NCBI GenBank (Tabla Suplementaria S1) ukanxa ClustalW ukampiwa Paquete de Análisis de Genética Evolutiva Molecular (MEGA-11; versión 11) (Kumar et al., 2024). Análisis evolutivo ukaxa luratarakiwa método de máxima probabilidad ukampi ukhamaraki modelo general de sustitución nucleótida reversible tiempo-pe (Nei y Kumar, 2000). Uka quqax juk’amp log-likelihood ukan uñacht’ayatawa. Qallta quqaxa heurística thakhi thaqhañatakixa ajllitawa, quqaxa juk’ampi log-probabilidad ukaniwa, vecino-joining (NJ) quqa (Kumar et al., 2024) ukhamaraki máxima parsimonia (MP) quqa taypina. NJ quqaxa luratarakiwa mä matriz de distancia parija ukampiwa uñakipata, ukaxa modelo general de tiempo-reversible ukampiwa lurataraki (Nei y Kumar, 2000).
Aka actividad antibacteriana L-ornitina ukhamaraki bactericida “Rizolex-T” ukjamaraki in vitro ukjamaraki difusión de agar ukjamaraki. Uñakipaña thakhi: Aka solución stock de L-ornitina (500 mg/L) ukjamaraki suma misturaki 10 ml de medio nutriente PDA ukjamaraki soluciones wakicht’añataki qhipa concentraciones 12,5, 25, 50, 75, 100 ukhamaraki 125 mg/L, ukjamaraki. Aka fungicida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L) ukjamaraki uma destilada estéril ukjamaraki control ukjamaraki. Uka medio ukaxa solidificado ukxaruxa, mä tapón micelial jichha wakicht’ata cultivo Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm de diámetro, ukxa apsutarakiwa plato Petri uksana chika taypiru ukhamaraki cultivada 25±2°C ukjamaru micelio ukaxa taqpacha plato control Petri uksaru ch’amanchañataki, ukxaruxa hongo jiltawi qillqantatarakiwa. Aka S. sclerotiorum uksa tuqita sapa patakata inhibición radial uksa tuqita jakhthapitawa ecuación 1 ukampiwa:
Aka yant’awixa pä kutiwa lurataraki, sapa grupo control/experimental ukatakixa suxta replicados biológicos ukjamaraki phisqa ollas (pä plantas sapa olla) sapa replicado biológico ukjamaraki. Sapa replicado biológico ukaxa pä kutiwa uñakipata (pä replicados técnicos) ukhamata chiqapa, confiabilidad ukhamaraki reproducibilidad uka yant’awinakanxa. Ukhamaraki, análisis de regresión de probit ukaxa luratarakiwa chikata máxima concentración inhibidora (IC50) ukhamaraki IC99 (Prentice, 1976) ukanakampi.
L-ornitina uksa tuqita invernadero uksanxa kunjamasa ch’amanchasi ukxa uñakipañatakixa, pä yant’awinaka olla uksa tuqita luratarakiwa. Mä juk’a pacharuxa, manq’añanakaxa phuqt’ayatarakiwa esterilizado laq’a-ch’alla uraqimpi (3:1) ukatxa inoculada mä jichha wakicht’ata cultivo de S. sclerotiorum ukampiwa. Nayraqata, aislado más invasivo de S. sclerotiorum (aislado #3) ukxa yapuchatarakiwa mä esclerotio chikata khuchhurata, ukxaruxa uñkatata aynacharu PDA uksaru uchaña ukhamaraki incubada 25 °C uksana constante ch’amakana (24 h) 4 urunaka ukhamata micelio jiltawi ch’amanchañataki. Ukxarusti pusi tapón de agar de 5 mm diámetro ukxa apsutarakiwa nayraqata tuqita apsutarakiwa 100 g de una mezcla estéril de trigo y salvado de arroz (1:1, v/v) ukjamaraki taqpacha matraz ukanakaxa incubadas 25 ± 2 °C ukjamaraki 12 h qhana/12 h ch’amaka ciclo 5 urunaka ukhamata esclerocia uñstayañataki. Taqi matraz ukanakana yänakapaxa suma ch’amanchatarakiwa, ukhamata homogeneidad uñstayañataki janïra uraqi yapxatkasa. Ukxarusti, 100 g de mezcla de salvado colonizador ukxa sapa manq’añaruxa apxatarakiwa ukhamata mä constante concentración de patógenos. Aka inoculadas ollas ukanakaxa umampiwa umampi activación de crecimiento de hongos ukjamaraki 7 urunaka invernadero ukana uchataraki.
Ukatxa sapa manq’añaruwa phisqa jatha Giza 3 kasta yapuchataraki. Aka manq’añatakixa L-ornitina ukhamaraki fungicida Rizolex-T ukanakampiwa lurataraki, ukatxa jatha esterilizada ukaxa nayraqata pä horawa umampi ch’allt’ataraki mä solución acuosa de los dos compuestos ukanxa mä qhipa concentración de IC99 niya 250 mg/L ukhamaraki 50 mg/L, ukjamaraki, ukxaruxa mä hora aire ukampiwa wañt’ayataraki janïra yapuchañataki. Maysa tuqitxa, jathanakaxa uma destilada estéril ukanwa ch’allt’ataraki control negativo ukhama. 10 urunakatxa, janïra nayrïri uma warantkasaxa, ch’uqixa jisk’achatawa, sapa manq’añaruxa pä suma q’uma ch’uqikiwa qhipararaki. Ukhamaraki, S. sclerotiorum ukampi infección utjañapatakixa, habas quqa ch’uqi ch’uqixa pachpa etapa de desarrollo (10 urunaka) pä yaqha chiqanakanwa khuchhurata mä bisturí esterilizada ukampiwa ukatxa niya 0,5 g de mezcla de salvado colonizador ukxa sapa usuchjataruwa uchataraki, ukxaruxa wali humedad ukampiwa infección ukhamaraki usunaka utjañapataki taqi inculados ayrunakanxa. Plantas de control ukaxa ukhamarakiwa usuchjata ukhamaraki mä kipka (0,5 g) de mezcla estéril, janïra colonizado de salvado ukanakaxa usuchjatarakiwa ukhamaraki mantenida en alta humedad ukhamata simulación de medio ambiente ukhamata usunaka utjañapataki ukhamaraki asegurar consistencia entre grupos tratamiento.
Uñakipaña thakhi: Jawasa ch’uqixa 500 ml de solución acuosa de L-ornitina (250 mg/l) jan ukaxa fungicida Rizolex-T (50 mg/l) ukampiwa umampi umampi warantataraki, ukxaruxa kimsa kutiwa lurataraki 10 urunaka. Aka controles tratados placebo ukjamaraki 500 ml de agua destilada estéril ukampiwa umampi irpataraki. Taqi tratamientos ukaxa luratarakiwa condiciones de invernadero (25 ± 2°C, 75 ± 1% humedad relativa, ukhamaraki fotoperiodo 8 h qhana/16 h ch’amaka). Taqi manq’añanakaxa pä semanawa umampi warantataraki ukatxa sapa phaxsiwa qullataraki abono equilibrado NPK (20-20-20, con 3,6% azufre y microelementos TE; Zain Seeds, Egipto) mä concentración 3–4 g/l ukjamaraki spray foliar ukjamaraki kunjamatixa iwxt’awinakaxa variedad específica ukatxa fabricante ukana kamachinakaparjama. Jani yaqha tuqita qhananchata, taqpacha jach’aptayata puquta laphinaka (2do ukhamaraki 3ri laphinaka patatpacha) apthapitawa sapa replicado biológico uksatxa 72 h post-tratamiento (hpt), homogeneizado, apthapita ukhamaraki imaña -80 °C uksana juk’ampi análisis ukatakixa, ukampisa janiwa limitadakiti, localización histoquímica in situquímica de indicadores de estrés oxidativo, peroxidación lípida, enzimática ukhamaraki no enzimática antioxidantes ukatxa expresión génica ukanakampi.
Janq’u moho infección intensidad ukaxa sapa semana 21 urunaka inoculación (dpi) ukjamaraki escala 1–9 (Tabla Suplementaria S2) ukjamaraki escala Petzoldt y Dickson (1996) modificada Teran et al. (2006) ukat juk’ampinaka. Mä juk’a pacharuxa, habas quqanakan ch’akhanakapa ukhamaraki ramanakapaxa uñakipatarakiw punto de inoculación uksatxa qalltasina, ukhamata lesiones ukanakaxa internodos ukhamaraki ganglios ukanakana progresión ukanaka arktañataki. Ukxarusti, lesión ukan jayankxatapax punto de inoculación ukat juk’amp jaya chiqaruw tronco jan ukax rama uksanx tuputaraki ukatx mä puntuación 1–9 ukjaw churataraki kawkhantix lesión ukax utjki ukarjama, kawkhantix (1) uñacht’ayiw jan uñjkañ infección ukax punto de inoculación jak’an utjki ukat (2–9) uñacht’ayiw juk’at juk’at jilxatata lesión tama ukat progresión nodos/internodos uksan (Tabla suplementario S2). Ukatxa janq’u moho infección intensidad ukaxa sapa patakata jaqukipatarakiwa fórmula 2 ukampiwa:
Ukhamaraki, área bajo la curva de progresión de enfermedades (AUDPC) ukaxa jakhthapitawa aka fórmula (Shaner y Finney, 1977), ukaxa jichha pachanakanxa adaptada ukhamawa janq’u ismuñapataki haba común (Chauhan et al., 2020) ecuación 3 ukampiwa:
Kawkhantixa Yi = usuxa ti pachana ch’amapaxa, Yi+1 = usuxa wali ch’amawa jutïri pachana ti+1, ti = nayrïri tupuña pacha (urunaka), ti+1 = jutïri tupuña pacha (urunakana), n = taqpacha pacha chimpunaka jan ukaxa uñjañ chiqanaka. Parámetros de crecimiento de habas ayrunakaxa ayru altura (cm), qhawqha ramanaka sapa ayru, ukhamaraki qhawqha laphinaka sapa ayruxa qillqt’atarakiwa sapa semana 21 urunaka taqi replicados biológicos ukanakana.
Sapa replicado biológico uksanxa, muestras de hojas (payïri ukhamaraki kimsïri laphinaka taqpacha jilxatata pata tuqita) apthapitawa 45 urunaka qullaña tukuyatatxa (15 urunaka qhipa qullaña tukuyatatxa). Sapa replicado biológico ukaxa phisqa manq’aña (pä quqa sapa manq’aña) ukanakampiwa lurataraki. Niya 500 mg ukja ch’uqi ch’uqitxa apsutarakiwa pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b ukhamaraki carotenoides) uksa apsuñataki 80% acetona 4 °C uksana ch’amakanxa. Aka 24 h ukjaruwa, muestras ukaxa centrifugada ukjamaraki sobrenadante ukjamaraki determinación de contenidos de clorofila a, clorofila b y carotenoides colorimétrica ukjamaraki espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) ukjamaraki (Lichtenthaler, 1987) ukjamaraki absorbancia kimsa longitudes de onda ukjamaraki (A470, A646 ukatxa A663 nm). Tukuyañatakixa, contenido de pigmentos fotosintéticos ukaxa jakhthapitawa aka fórmulas 4–6 ukanakampi Lichtenthaler (1987) jupana qhananchata.
Aka 72 h post-tratamiento (hpt), laphinaka (payïri ukhamaraki kimsïri laphinaka taqpacha desarrollada patatpacha) apthapitawa sapa replicado biológico uksatxa localización histoquímica in situ peróxido de hidrógeno (H2O2) ukhamaraki anión superóxido (O2•−) ukanakataki. Sapa replicado biológico ukaxa phisqa manq’aña (pä quqa sapa manq’aña) ukanakampiwa lurataraki. Sapa replicado biológico ukaxa uñakipatarakiw pä kuti (pä replicados técnicos) ukhamata chiqapa, confiabilidad ukhamaraki reproducibilidad uka lurawixa uñjañataki. Aka H2O2 ukhamaraki O2•− ukjamaraki 0,1% 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) jan ukaxa tetrazolio nitroazul (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), ukjamaraki, aka lurawixa Romero-Puertas et al. (2004) ukat Adam ukat yaqhanakampi. (1989) jupanakax jisk’a mayjt’awinakampiw uñacht’ayapxäna. Aka localización histoquímica de H2O2 in situ uksa tuqita, folletos ukanakaxa infiltrados al vacío 0,1% DAB ukjamaraki tampón Tris 10 mM (pH 7,8) ukjamaraki incubadas a temperatura ambiente en la luz 60 min. Aka pankanakaxa 0,15% (v/v) TCA ukjamaraki 4:1 (v/v) etanol:cloroformo (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) ukjamaraki qhanampiwa ch’amakt’ayataraki. Ukhamaraki, válvulas ukanakaxa infiltradas vacío ukjamaraki tampón fosfato potásico 10 mM (pH 7,8) ukjamaraki 0,1 p/v % HBT ukjamaraki localización histoquímica de O2•− in situ. Aka folletos ukaxa incubadas en la luz temperatura ambiente 20 min, ukxaruxa blanqueada kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata, ukxaruxa qhant’ayatarakiwa ch’amaka azul/violeta manchas uñstañakama. Uka ch’amanchawix marrón (mä H2O2 uñacht’ayirjama) jan ukax ch’uxña-violeta (mä O2•− uñacht’ayirjama) colores ukanakax uñakipatawa, ukax versión fiyi ukampiw uñakipata, ukax paquete de procesamiento de imágenes ImageJ (http://fiji.sc; 7 uru achuqa phaxsit 2024 maran uñakipata).
Aka malondialdehído (MDA; mä marcador de peroxidación de lípidos) ukjamaraki Du ukhamaraki Bramlage (1992) jupanakana lurawiparjama mä jisk’a mayjt’awinakampi. Sapa replicado biológico uksatxa laphinakawa (payïri ukhamaraki kimsïri laphinakapaxa taqpacha ch’amanchata patatpacha) apthapitawa 72 h post-tratamiento (hpt). Sapa replicado biológico ukaxa phisqa manq’aña (pä quqa sapa manq’aña) ukanakampiwa lurataraki. Sapa replicado biológico ukaxa uñakipatarakiw pä kuti (pä replicados técnicos) ukhamata chiqapa, confiabilidad ukhamaraki reproducibilidad uka lurawixa uñjañataki. Mä juk’a pacharuxa, 0,5 g uraqina laphina tejidos ukjamaraki MDA uksa apsuñatakixa 20% ácido tricloroacético (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, EE.UU.) ukjamaraki 0,01% hidroxitolueno butilado (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) ukjamaraki. Ukxarusti, contenido MDA ukaxa sobrenadante uksanxa colorimétricamente uñakipatarakiw absorbancia 532 ukhamaraki 600 nm ukjamaraki espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) ukjamaraki expresada nmol g−1 FW.
Antioxidantes no enzimáticos ukhamaraki enzimáticos ukanaka uñakipañatakixa, laphinaka (payïri ukhamaraki kimsïri laphinaka taqpacha jilxatata patatpacha) apthapitawa sapa replicado biológico uksatxa 72 h post-tratamiento (hpt). Sapa replicado biológico ukaxa phisqa manq’aña (pä quqa sapa manq’aña) ukanakampiwa lurataraki. Sapa muestra biológica ukaxa pä kuti uñakipatawa (pä muestra técnica). Pä laphixa nitrógeno líquido ukampiwa ch’uqimpi ch’uñuyataraki ukatxa chiqapa apnaqatarakiwa antioxidantes enzimáticos ukhamaraki no enzimáticos, aminoácidos totales, contenido de prolina, expresión génica, ukhamaraki cuantificación de oxalato ukanaka yatxatañataki.
Aka fenólicos solubles totales ukaxa yatxatatarakiwa reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ukampiwa mä jisk’a mayjt’awinakampi aka lurawimpi aka Kahkonen et al. (1999) ukat juk’ampinaka. Mä juk’a pacharuxa, niya 0,1 g de tejido homogeneizado de homogeneizado ukxa apsutarakiwa 20 ml de metanol 80% ukjamaraki ch’amakaru 24 h ukjamaraki sobrenadante ukxa apthapitawa centrifugación ukxaru. Aka 0,1 ml ukjamaraki extracto de muestra ukjamaraki 0,5 ml de reactivo Folin-Ciocalteu (10%) ukjamaraki 30 s ukjamaraki ch’amakaru jaytatarakiwa 5 min. Ukxarusti 0,5 ml de solución de carbonato de sodio 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, El Cairo, Egipto) ukjamaraki sapa tubo ukjamaraki, suma misturaki ukhamaraki incubada temperatura ambiente ukjamaraki ch’amakaru 1 h. Uka incubación ukxaruxa, absorbancia de la mezcla de reacción ukaxa 765 nm ukjamawa espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) ukampiwa uñakipata. Aka concentración de fenoles solubles totales ukaxa extractos de muestra uksanxa yatxatatarakiwa curva de calibración de ácido gálico (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE.UU.) ukjamaraki uñacht’ayatarakiwa miligramos de ácido gálico equivalente por gramo de peso fresco (mg GAE g-1 peso fresco).
Aka contenido total de flavonoides solubles ukaxa yatxatatarakiwa aka lurawimpi Djeridane et al. (2006) jupanakax mä juk’a mayjt’awinakampiw uñacht’ayapxäna. Mä juk’a pacharuxa, 0,3 ml ukjamaraki aka extracto de metanol ukjamaraki 0,3 ml de solución de cloruro de aluminio 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ukjamaraki ch’amampiwa ch’amanchataraki ukatxa incubadas a temperatura ambiente 5 min, ukxaruxa 0,3 ml de solución de acetato de potasio 10% (Al-Gomhoria) ukjamaraki Farmacéutico y Suministros Médicos, El Cairo, Egipto), suma misturaki ukatxa incubada temperatura ambiente uksana 30 min ch’amaka. Uka incubación ukxaruxa, absorbancia de la mezcla de reacción ukaxa 430 nm ukjamawa espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) ukampiwa uñakipata. Aka concentración de flavonoides totales solubles ukanakaxa extractos de muestra uksanxa yatxatatarakiwa curva de calibración de rutina (TCI América, Portland, OR, EE.UU.) ukjamaraki miligramos de rutina equivalente por gramo de peso fresco (mg RE g-1 peso fresco).
Aka taqpacha aminoácidos libres ukanakaxa jawasa laphinakanxa yatxatatarakiwa mä reactivo de ninhidrina modificado (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE.UU.) ukampiwa lurataraki aka lurawimpi Yokoyama ukhamaraki Hiramatsu (2003) ukanakampi ukhamaraki mayjt’ayata Sun et al. (2006) ukat juk’ampinaka. Mä juk’a pacharuxa, 0,1 g de tejido tierra ukjamaraki tampón pH 5,4 ukjamaraki 200 μL de sobrenadante ukjamaraki 200 μL de ninhidrina (2%) ukhamaraki 200 μL de piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) ukjamaraki, incubadas en baño de agua ebullida 30 min, ukxaruxa thayt’ayatarakiwa ukatxa medida a 580 nm ukjamaraki espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japón) ukampiwa lurataraki. Maysa tuqitxa, prolina ukaxa yatxatatarakiwa Bates ukjamaraki (Bates et al., 1973). Aka prolina ukxa apsutarakiwa 3% ácido sulfosalicílico (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EE.UU.) ukjamaraki centrifugación ukxaruxa, 0,5 ml de sobrenadante ukxa apsutarakiwa 1 ml de ácido acético glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE.UU.) ukhamaraki reactivo ninhidrina ukjamaraki, incubada a 90 °C 45 min, thayampi ukhamaraki tuputa 520 nm ukjamaraki pachpa espectrofotómetro ukjamaraki aka pata tuqina. Aka aminoácidos libres totales ukhamaraki prolina ukjamaraki extractos de hojas uksanakanxa yatxatatarakiwa curvas de calibración de glicina ukhamaraki prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), ukjamaraki mg/g fresco peso ukjamaraki.
Aka actividad enzimática enzimas antioxidantes ukanaka yatiñatakixa, niya 500 mg de tejido homogeneizado ukjamaraki 3 ml de tampón Tris 50 mM (pH 7,8) ukjamaraki 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE.UU.) ukjamaraki 7,5% de polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA), centrifugado 10.000 × g 20 min refrigeración (4 °C), ukjamaraki sobrenadante (extracto de enzimas crudas) ukjamaraki apthapitawa (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ukxarusti catalasa (CAT) ukjamaraki 2 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ukhamaraki 100 μl de solución 269 mM H2O2 ukjamaraki actividad enzimática ukaxa Aebi (1984) ukjamaraki mä jisk’a modificaciones (El-Nagar et al., 2023; Osman ukat yaqhanakampi, 2023). Aka actividad enzimática peroxidasa dependiente de guaiacol (POX) ukjamaraki Harrach et al. (2009) ukat juk’ampinaka. (2008) ukjamaraki jisk’a modificaciones (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ukhamaraki actividad enzimática de la polifenol oxidasa (PPO) ukjamaraki reacción ukjamaraki 2,2 ml de tampón de fosfato sódico 100 mM (pH 6,0), 100 μl de guaiacol (químicos TCI, Portland, OR, USA) ukjamaraki 100 μl de 12 mM H2O2 ukjamaraki. Uka lurawixa mä juk’a mayjt’ayatawa (El-Nagar ukatxa, 2023; Osman ukatxa, 2023). Aka ensayo ukjamaraki reacción ukjamaraki 3 ml de solución de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) ukjamaraki jichha wakicht’ata tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0) ukjamaraki. Aka actividad CAT ukaxa uñakipatarakiw descomposición de H2O2 240 nm (A240), actividad POX ukaxa uñakipatarakiw observación de absorbancia jilxatata 436 nm (A436), ukhamaraki actividad PPO ukaxa uñakipatarakiw registro de fluctuaciones de absorbancia 495 nm (A495) sapa 30 s 3 min ukjamaraki UV-160A ukampi espectrofotómetro (Shimadzu, Japón) uka markanwa jikxatasi.
Aka RT-PCR en tiempo real ukaxa luratarakiwa niveles de transcripción kimsa antioxidantes ukanakampi chikañchata, akaxa catalasa peroxisómica (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superóxido dismutasa (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), ukhamaraki glutationa reductasa (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), jawasa laphinakanxa (payïri ukhamaraki kimsïri taqpacha ch’amanchata laphinakawa patatpacha) 72 h qhipa qullaña tukuyatatxa. Mä juk’a pacharuxa, ARN ukaxa apsutarakiwa Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) ukampiwa protocolo fabricante ukarjama. Ukxarusti, ADNc ukaxa sintetizatarakiwa TOP scriptTM CDNA Synthesis Kit ukampiwa lurataraki kunjamatixa lurawixa siski ukhama. Aka kimsa genes ukanakan secuencias de primeros ukanakax Tabla Suplementaria S3 ukan uñacht’ayatawa. Aka PvActin-3 (Número de adhesión GenBank: XM_068616709.1) ukjamaraki gen de mantenimiento de casa ukjamaraki expresión génica relativa ukaxa jakhthapitawa aka método 2-ΔΔCT (Livak y Schmittgen, 2001). Uñacht’ayatarakiwa estabilidad de actina estrés biótico (interacción incompatible entre legumbres comunes y el hongo antracnosa Colletotrichum lindemuthianum) ukhamaraki estrés abiótico (sequía, salinidad, baja temperatura) (Borges et al., 2012).
Qalltanxa lurapxaraktwa mä análisis de silico genoma-wide de proteínas oxaloacetato acetilhidrolasa (OAH) ukjamaraki S. sclerotiorum ukjamaraki herramienta BLAST proteína-proteína (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Mä juk’a arumpixa, OAH ukjamaraki Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; táxido: 1191702; GenBank acceso número XP_040799428.1; 342 aminoácidos) ukhamaraki Penicillium lagena (PlOAH; táxido: 94218; GenBank acceso número XP_056833920.1;316 aminoácidos) ukjamaraki secuencias de consulta ukjamaraki mapeo de proteína homóloga S. sclerotiorum (táxido: 5180) uksana. BLASTp ukaxa luratarakiwa aka qhipa uñakipata S. sclerotiorum genoma ukatxa GenBank ukanxa Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) ukan sitio web ukanxa, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ukhamaraki, aka gen OAH predecido S. sclerotiorum (SsOAH) ukatxa análisis evolutivo ukhamaraki quqa filogenético AfOAH ukatxa A. fijiensis CBS 313.89 ukatxa PlOAH P. lagena ukatxa inferido ukhamaraki método de máxima probabilidad MEGA11 (Tamura et al., 2021) ukhamaraki modelo basado en matriz JTT (Jones et al., 1992 ukat juk’ampinaka). Aka quqa filogenética ukaxa mayachatarakiwa análisis de alineación múltiple de secuencias proteicas de todos los genes OAH predecidos (SsOAH) de S. sclerotiorum ukatxa secuencia de consulta ukampixa Herramienta de Alineación Basada en Constreñimiento (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos y Agarwala, 2007 marana). Ukhamaraki, suma uñakipata secuencias de aminoácidos SsOAH ukatxa S. sclerotiorum uksatxa, uñakipatarakiw secuencias de consulta (AfOAH y PlOAH) (Larkin et al., 2007) ukampi ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ukatxa regiones conservadas ukanakaxa alineación uksanxa uñacht’ayatarakiwa herramienta ESPript (versión 3.0; Ukhamaraki, ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasirakispa.
Ukhamaraki, dominios representativos funcionales predecidos ukatxa sitios conservados de S. sclerotiorum SsOAH ukaxa interactivamente uñakipatawa kunaymana familianakaru herramienta InterPro ukampi (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Tukuyañatakixa, kimsa dimensional (3D) estructura modelado ukaxa S. sclerotiorum SsOAH predecido ukampi luratarakiwa Motor de Reconocimiento de Homología/Analogía Proteína (Phyre2 servidor versión 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ukampi validada ukampi ukax SWISS-MODEL servidor (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini ukat yaqhanakampi, 2014). Uka yatiyata kimsa dimensiones (formato PDB) ukanakaxa interactivamente uñacht’ayatarakiwa UCSF-Chimera ukampi (versión 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Aka PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real ukaxa luratarakiwa nivel transcripcional de oxaloacetato acetilhidrolasa (SsOAH; número de adhesión GenBank: XM_001590428.1) ukjamaraki micelios de Sclerotinia sclerotiorum uksana. Mä juk’a pacharuxa, S. sclerotiorum ukxa inoculada mä matraz ukanxa PDB ukjamaraki incubadora de shaking (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EE.UU.) 25 ± 2 °C 24 h 150 rpm ukjamaraki constante ch’amaka (24 h) ukjamaraki micelio jiltawi ch’amanchañataki. Ukxarusti, celulanakaxa L-ornitina ukhamaraki fungicida Rizolex-T ukanakampiwa lurataraki qhipa concentraciones de IC50 (niya 40 ukhamaraki 3,2 mg/L, ukjamaraki) ukjamaraki yaqha 24 h ukjamaraki pachpa condiciones ukanakampiwa yapuchataraki. Incubación ukxaruxa, cultivos ukaxa centrifugados a 2500 rpm 5 min ukjamaraki sobrenadante (micelio hongo) ukjamaraki análisis de expresión génica ukjamaraki. Ukhamaraki, micelio hongo ukaxa apthapitawa 0, 24, 48, 72, 96, 120 h post-infección ukjamaraki infectadas sata quqanakatxa, ukaxa janq’u moho ukhamaraki micelio algodón ukjamaraki infectados tejidos ukjamaraki. ARN ukaxa apsutarakiwa micelio hongo uksatxa ukatxa ADNc ukxa sintetizatarakiwa kunjamatixa nayraqata uñacht’ayataki ukhama. SsOAH ukatakixa secuencias de primeros ukanakaxa Tabla Suplementaria S3 ukanwa uñacht ayata. Aka SsActin (Número de adhesión GenBank: XM_001589919.1) ukjamaraki gen de mantenimiento de casa ukjamaraki expresión génica relativa ukjamaraki 2-ΔΔCT ukjamaraki (Livak y Schmittgen, 2001).
Aka ácido oxálico ukjamaraki caldo de dextrosa de papa (PDB) ukjamaraki muestras de plantas ukjamaraki patógeno hongo Sclerotinia sclerotiorum ukjamaraki Xu ukhamaraki Zhang (2000) ukanakana lurawiparjama mä jisk’a mayjt’awinakampi. Mä juk’a pacharuxa, S. sclerotiorum aislados ukaxa inoculados ukhamawa matraz ukanakaru PDB ukampi ukatxa cultivadas mä incubadora de shaking (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EE.UU.) 150 rpm a 25 ± 2 °C 3–5 urunaka constante ch’amaka (24 h) ukhamata ch’amañchañataki micelio jiltawi. Incubación ukxaruxa, cultivo de hongos ukaxa nayraqata filtrado ukhamawa papel filtrante Whatman #1 ukjamaraki centrifugado 2500 rpm 5 min ukjamaraki micelio residual uksa apsuñataki. Aka sobrenadante ukxa apthapitawa 4 °C uksana juk’ampi determinación cuantitativa oxalato uksa tuqita. Ayrunaka muestras wakicht’añatakixa, niya 0,1 g de fragmentos de tejido de plantas ukjamaraki kimsa kutiwa apsutarakiwa destilada umampi (2 ml sapa kuti). Ukxarusti muestras ukaxa centrifugada 2500 rpm 5 min, ukatxa sobrenadante ukaxa waña filtrado ukhamawa Whatman No 1 filtrado papel ukampi ukatxa apthapitawa juk’ampi análisis ukataki.
Análisis cuantitativo de ácido oxálico uksa tuqita, aka mezcla de reacción ukxa wakicht’atarakiwa mä tubo tapón de vidrio uksana aka ordenan: 0,2 ml de muestra (jan ukaxa filtrado de cultivo PDB jan ukaxa solución estándar de ácido oxálico), 0,11 ml de azul bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EE.UU.), 0,198 ml de ácido sulfúrico 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Cairo, Egipto) ukjamaraki 0,176 ml de dicromato potásico 100 mM (K2Cr2O7; químicos TCI, Portland, OR, EE.UU.), ukjamaraki aka solución ukaxa 4,8 ml ukjamawa destilada umampi, wali ch’amampi ch’amanchata ukatxa jank’akirakiw 60 °C umaru uchataraki litrina. Aka 10 min ukjaruwa, aka reacción ukaxa sayt’ayatarakiwa 0,5 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH; 0,75 M). Aka absorbancia (A600) ukjamaraki reacción mixta ukjamaraki 600 nm ukjamaraki espectrofotómetro UV-160 (Shimadzu Corporation, Japón) ukjamaraki. PDB ukhamaraki uma destilada ukaxa controles ukjamawa apnaqatarakiwa cuantificación de filtros de cultivo ukhamaraki muestras de plantas, ukjamaraki. Aka filtros de cultivo uksanxa, microgramos de ácido oxálico sapa mililitro de medio PDB (μg.mL−1) ukjamaraki extractos de hojas ukjamaraki microgramos de ácido oxálico sapa gramo fresco peso (μg.g−1 FW) ukjamaraki, uñakipatarakiw curva de calibración de ácido oxálico (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Taqi yatxatawi taypinxa, taqi yant’awinakaxa luratarakiwa mä diseño completamente aleatorizado (CRD) ukanxa suxta replicados biológicos sapa tratamiento ukatxa phisqa ollas sapa replicado biológico (pä quqa sapa olla) jani ukaxa yaqha tuqita qhananchata. Replicados biológicos ukanakaxa pä kuti uñakipatawa (pä replicados técnicos). Replicados técnicos ukaxa pachpa yant’awina reproducibilidad uñakipañatakixa apnaqatarakiwa ukampisa janiwa análisis estadístico uksanxa apnaqatäkiti, ukhamata jani replicaciones espurias ukanaka utjañapataki. Uka yatxatawixa estadísticamente uñakipatarakiw análisis de varianza (ANOVA) ukampiwa, ukxaruxa Tukey-Kramer honestamente significativa diferencia (HSD) yant’awimpiwa uñakipata (p ≤ 0,05). Aka yant’awinaka in vitro ukjamaraki, IC50 ukhamaraki IC99 ukjamaraki modelo de probit ukjamaraki 95% intervalos de confianza ukjamaraki.
Taqpachaxa pusi aislados ukanakawa apthapita kunaymana soya yapunakatxa, Gobernación El Ghabiya, Egipto uksana. Medio PDA uksanxa, taqpacha aislados ukanakaxa micelio janq’u cremoso uksa apsutarakiwa ukaxa jank’akirakiw algodón janq’uruw tuku (Figure 1A) ukatxa beige jan ukaxa marrón etapa de esclerocio uksanxa. Esclerocia ukaxa jilpachaxa denso, ch’iyara, esférica jan ukaxa irregular uñtatawa, 5,2 ukatxa 7,7 mm largo ukhamaraki 3,4 ukatxa 5,3 mm diámetro (Figure 1B). Ukhamaraki, pusi aislados ukanakaxa mä patrón marginal de esclerotia uñstayapxi aka medio de cultivo uksana 10–12 urunaka incubación 25 ± 2 °C ukjamaru (Fig. 1A), aka esclerocia sapa placa uksanxa wali mayjawa jupanakkamaxa (P < 0,001), ukatxa aislado 3 uksanxa jilpachawa esclerotia ukjamaraki (32,33 ± 1,53 esclerotia por placa ukat Fig. 1C). Ukhamaraki, aislado #3 ukjamaraki PDB uksanxa juk’ampi ácido oxálico ukjamaraki yaqha aislados ukjamaraki (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Aislado #3 ukaxa uñacht’ayiwa típicas características morfológicas ukhamaraki microscópicas aka hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum. Sañäni, PDA uksanxa, colonias de aislado #3 ukaxa jank’akiw jilxattawayi, cremoso janq’u (Figure 1A), beige inverso jan ukaxa salmón ligero q’illu-marrón, ukatxa 6-7 urunakawa 25 ± 2°C uksanxa taqpacha mä placa 9 cm diámetro uksa tuqiru ch’amanchañataki. Aka pata tuqina características morfológicas ukhamaraki microscópicas ukanakatxa, aislado #3 ukaxa Sclerotinia sclerotiorum sata uñt’atarakiwa.
Figura 1. Características ukhamaraki patogenicidad de S. sclerotiorum aislados de legumbres comunes juyranakatxa. (A) Pusi aislados de S. sclerotiorum ukjamaraki medio PDA ukjamaraki esclerotio ukjamaraki pusi aislados S. sclerotiorum ukjamaraki (C) esclerotia (sapa placa), (D) secreción de ácido oxálico medio PDB ukjamaraki (μg.mL−1), ukhamaraki (E) secreción de ácido oxálico (%) pusi aislados de S. sclerotiorum ukjamaraki legumbre comercial susceptible ukjamaraki cultivar Giza 3 ukaxa invernadero ukankiwa. Valores ukaxa uñacht’ayiwa promedio ± SD phisqa replicados biológicos (n = 5). Kunaymana qillqanakaxa uñacht’ayiwa estadísticamente significativas mayjt’awinaka qullaña taypina (p < 0,05). (F–H) Sintomas típicos de moho blanco ukaxa uñstawayiwa tallos superiores ukhamaraki sílices ukanakana, ukjamaraki, 10 urunaka inoculación ukjata aislado #3 (dpi) ukampiwa. . Jakhunakax clustering lineas ukanx suyun cobertura (%) uñacht’ayi, ukatx clustering lineas ukanakat anqax jakhunakax rama largo uñacht’ayi.
Ukhamaraki, patogenicidad chiqapa lurañatakixa, pusi aislados de S. sclerotiorum obtenidos ukanakaxa inoculación susceptible cultivar de habas comerciales Giza 3 ukjamaraki condiciones de invernadero ukjamaraki, ukaxa postulatos de Koch ukanakampiwa chikachasiña (Fig. 1E). Taqi aka aislados de hongos apsutanakaxa patógenos ukhamaraki ch’uxña jawasa (cv. Giza 3) uksaruwa usuchjaspa, ukaxa sintoma típicos de moho blanco ukanakampiwa taqi uraqi pata tuqina (Fig. 1F), juk’ampirusa tallos (Fig. 1G) ukhamaraki vainas (Fig. 1H) ukanakana 10 urunaka inoculación (dpi) ukjakama, aislado 3 ukaxa juk’ampi agresivo aislado ukhamawa pä experimentos independientes ukanxa. Aka aislado 3 uksanxa jilpachawa usuxa (%) jawasa ayrunakanxa (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, ukhamaraki 76,7 ± 3,1 7, 14, ukhamaraki 21 urunaka infección ukxaruxa, ukjamaraki; Figura 1F).
Aka identificación de la aislado de S. sclerotiorum #3 ukaxa juk’ampi ch’amanchatarakiwa secuenciación espaciador transcrito interno (ITS) ukampiwa (Fig. 1I). Análisis filogenético aislado #3 ukatxa 20 aislados/cepas de referencia ukanakampixa wali uñtasitawa (>99%) jupanakkamaxa. Ukhamaraki, aka S. sclerotiorum aislado #3 (533 bp) ukaxa wali uñtasitawa aka S. sclerotiorum aislado americano LPM36 ukjamaraki waña guisante jathata (número de acceso a GenBank MK896659.1; 540 bp) ukhamaraki aislado chino S. sclerotiorum YKY211 (número de acceso a GenBank OR206374.1;548 bp), ukaxa violeta (Matthiola incana) ukjamaraki ch’uqi ch’uqi ch’uqiruwa puriyi, taqi ukanakaxa sapa mayniru qutucht’atawa dendrograma uksana (Figure 1I). Machaq secuencia ukaxa NCBI ukana uñakipatawa ukatxa “Sclerotinia sclerotiorum – aislar YN-25” (número de adhesión GenBank PV202792) sutimpi uñt’atawa. Uñakipatarakiw aislado 3 ukax juk’amp invasivo aislado ukhamawa; ukatwa, aka aislado ukax taqi qhipa yant’awinakan yatxatañatakix ajllitaraki.
Aka actividad antibacteriana aka diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) ukjamaraki kunaymana concentraciones (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L) ukjamaraki aislado S. sclerotiorum 3 ukjamaraki in vitro ukjamaraki. Ukhamaraki, L-ornitina ukaxa mä efecto antibacteriano ukjamaraki juk’ata juk’ata jark’aqaraki aka radial jiltawi S. sclerotiorum hyphae ukjamaraki dosis ukjamaraki (Figure 2A, B). Aka jilpacha concentración yant’ata (125 mg/L), L-ornitina uñacht’ayiwa jilpacha tasa de inhibición de inhibición de crecimiento micelio (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), ukaxa kikiparakiwa fungicida comercial Rizolex-T (tasa de inhibición 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) ukjamaraki jilpacha concentración yant’ata (10 mg/L), ukaxa uñacht’ayiwa niya kipkakïtapa eficacia ukaxa wali askiwa.
Figura 2. Actividad antibacteriana in vitro ukaxa L-ornitina ukjamaraki Sclerotinia sclerotiorum ukjamaraki. (A) Aka actividad antibacteriana ukjamaraki kunaymana concentraciones de L-ornitina ukjamaraki S. sclerotiorum ukjamaraki fungicida comercial Rizolex-T (10 mg/L) ukjamaraki. (B, C) Tasa de inhibición (%) de crecimiento micelio de S. sclerotiorum ukjamaraki tratamiento ukjamaraki kunaymana concentraciones de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 y 125 mg/L) jan ukaxa Rizolex-T (2, 4, 6, 8 y 10 mg/L), ukjamaraki. Valores ukaxa uñacht’ayiwa promedio ± SD phisqa replicados biológicos (n = 5). Kunaymana qillqanakaxa qullaña taypina mayjt awinaka estadística uñacht ayi (p < 0,05). (D, E) Análisis de regresión modelo de Probit ukaxa L-ornitina ukhamaraki fungicida comercial Rizolex-T, ukjamaraki. Línea de regresión modelo de probit ukaxa mä línea sólida ch’iyara uñacht’ayatawa, ukatxa intervalo de confianza (95%) ukaxa mä línea roja discontinua uñacht’ayatawa.
Ukhamaraki, análisis de regresión de probit ukjamaraki parcelas correspondientes ukanakaxa uñacht ayatawa Tabla 1 ukhamaraki Figuras 2D,E ukanakampi. Mä juk’a pacharuxa, aka valor de pendiente aceptable (y = 2,92x − 4,67) ukhamaraki asociadas estadísticas significativas (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 ukhamaraki p < 0,0001; Figura 2D) L-ornitina ukjamaraki mä jach’a actividad antifúngica S. sclerotiorum ukjamaraki fungicida comercial ukanakampi chikachasiñataki Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 ukhamaraki p < 0,0001) (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de concentración máxima inhibidora (IC50) ukhamaraki IC99 (mg/l) de L-ornitina ukhamaraki fungicida comercial “Rizolex-T” ukjamaraki S. sclerotiorum ukjamaraki.
Taqi tuqitxa, L-ornitina (250 mg/L) ukaxa wali jisk’acharaki janq’u moho uksa tuqita ukhamaraki sinti ch’amanchata tratadas de habas comunes uksa tuqina, jani tratadas S. sclerotiorum uksa tuqita (control; Figura 3A). Mä juk’a arumpixa, jani qullata infectadas controles sata quqanakanxa usuxa juk’ata juk’ata jilxatarakiwa (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, ukhamaraki 92,33 ± 3,06%), L-ornitina ukaxa wali jisk’acharaki usuta (%) taqpacha yant’awina (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, ukhamaraki 26,36 ± 3,07) 7, 14, 21 urunakata qullaña tukuyatatxa (dpt), ukjamaraki (Figure 3A). Ukhamaraki, kunapachatixa S. sclerotiorum ukampiwa infectadas de habas ayrunakaxa 250 mg/L L-ornitina ukjamaraki área bajo la curva de progresión de enfermedades (AUDPC) ukjamaraki 1274,33 ± 33,13 ukjamaraki control janïra tratado ukjamaraki 281,03 ± 7,95 ukjamaraki, ukaxa mä juk’a jisk’akiwa control positivo 50 mg/L ukjamaraki Fungicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B) ukjamaraki. Payïr yant’äwinx pachpa saräwiw uñjasiraki.
Fig. 3. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina ukjamaraki janq’u ismuwi ch’uqi común ukjamaraki Sclerotinia sclerotiorum ukjamaraki invernadero ukjamaraki. (A) Curva de progresión de enfermedades de moho blanco de habas común ukjamaraki 250 mg/L L-ornitina ukjamaraki. (B) Área bajo la curva de progresión de enfermedades (AUDPC) de moho blanco de habas común ukjamaraki L-ornitina ukampiwa qullasi. Valores ukaxa uñacht’ayiwa promedio ± SD phisqa replicados biológicos (n = 5). Kunaymana qillqanakaxa qullaña taypina mayjt awinaka estadísticamente significativa uñacht ayi (p < 0,05).
Aplicación exógena de 250 mg/L L-ornitina ukjamaraki juk’ata juk’ata ayrunaka alturapa jilxatayaraki (Fig. 4A), qhawqha ramas sapa quqaru (Fig. 4B), ukhamaraki sapa ayru laphinaka (Fig. 4C) 42 urunakata. Ukhamaraki, fungicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) ukaxa jilpachawa taqi parámetros nutricionales uñakipata, ukampirusa aplicación exógena de 250 mg/L L-ornitina ukaxa payïri jach’a ch’amanchawiwa controles janïra tratados ukanakampi chikachasiñataki (Figs. 4A–C). Maysa tuqitxa, L-ornitina ukjamaraki tratamiento ukaxa janiwa mä jach’a efectos uñacht’aykiti aka contenido de pigmentos fotosintéticos clorofila a (Fig. 4D) ukhamaraki clorofila b (Fig. 4E), ukampisa mä juk’a jilxatarakiwa taqpacha contenido de carotenoides (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) ukjamaraki control negativo (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) ukjamaraki control positivo (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Taqi kuna, aka yatxatawixa uñacht’ayiwa L-ornitina ukaxa janiwa fitotóxica ukhama qullata legumbres ukanakatakixa ukhamaraki inasa jiltawiparuxa ch’amancharakchispa.
Fig. 4. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina en características de crecimiento ukhamaraki pigmentos fotosintéticos de habas laphinakaru infectadas Sclerotinia sclerotiorum ukampiwa invernadero ukanxa. (A) Ayrunaka alturapa (cm), (B) Jakhuwi ramanaka sapa ayru, (C) Jakhuwi laphinaka sapa ayru, (D) Clorofila a a (mg g-1 fr wt), (E) Clorofila b (mg g-1 fr wt), (F) Taqi carotenoides (mg g-1 fr wt). Valores ukaxa promedio ± SD ukjamaraki phisqa replicados biológicos (n = 5). Kunaymana qillqanakaxa uñacht’ayiwa estadísticamente significativas mayjt’awinaka qullaña taypina (p < 0,05).
Localización histoquímica in situ de especies de oxígeno reactivo (ROS; expresado como peróxido de hidrógeno [H2O2]) ukhamaraki radicales libres (expresados ​​como aniones superóxidos [O2•−]) uñacht’ayiwa aplicación exógena de L-ornitina (250 mg/L) ukaxa wali jisk’acharakiw acumulación de H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) ukhamaraki O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) ukjamaraki acumulación de ambos infectados infectados (173,31 ± 12,06 ukhamaraki 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, ukjamaraki) ukhamaraki ayrunakaxa 50 mg/L de fungicida comercial ukampiwa qullasi Rizolex-T (170,12 ± 9,50 ukhamaraki 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, ukjamaraki) 72 h. Jach’a niveles de H2O2 ukatxa O2•− ukanakaxa hpt uksanxa tantachatarakiwa (Fig. 5A, B). Ukhamaraki, ensayo basado en TCA de malondialdehído (MDA) uñacht’ayiwa S. sclerotiorum ukampiwa infectadas de habas ayrunakaxa jilpacha niveles de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) ukjamaraki laphinakaparu apthapita (Fig. 5C). Ukampirusa, aplicación exógena de L-ornitina ukaxa wali jisk’acharaki peroxidación lípida ukjamaraki uñacht’ayatarakiwa jisk’achata contenido MDA ukjamaraki tratamiento ukjamaraki (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efecto de la aplicación exógena de L-ornitina en los grandes marcadores de estrés oxidativo ukhamaraki mecanismos de defensa antioxidante no enzimático ukanakaxa jawasa laphinakaru infectada S. sclerotiorum ukampiwa 72 h post-infección ukanxa condiciones de invernadero ukanxa. (A) Peróxido de hidrógeno (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt, (B) anión superóxido (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt, (C) malondialdehído (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt, (D) taqpacha fenólicos solubles (mg GAE g−1 FW) 72 hpt, (E) taqpacha flavonoides solubles (mg RE g−1 FW) 72 hpt, (F) taqpacha aminoácidos libres (mg g−1 FW) 72 hpt, ukhamaraki (G) contenido de prolina (mg g−1 FW) 72 hpt. Aka valores ukaxa uñacht’ayiwa promedio ± desviación estándar (media ± DS) 5 replicados biológicos (n = 5). Kunaymana qillqanakaxa uñacht’ayiwa estadísticamente significativas mayjt’awinaka qullaña taypina (p < 0,05).