Aka ordenación proteica ukaxa secretora thakhinxa wali wakiskiriwa compartimentación celular ukhamaraki homeostasis ukanaka utjañapataki. Ukhamaraki, clasificación mediada por cáscaras ukatxa, lípidos ukanakana lurawipaxa clasificación de kinesina uksanxa proceso de transporte secreto uksanxa mä jiskt’awi básica nayra pachanakawa, ukaxa janiwa jichhakamaxa jaysatäkiti. Aka tuqinxa, lurapxaraktwa 3D simultáneo multicolor alta resolución chiqapa pachana imajinas uñacht’ayañataki in vivo uñacht’ayañataki machaq sintetizadas proteínas inmovilizadas glicosilfosfatidilinositol ukanakampi wali jaya fracciones lípidas ceramida ukanakampixa agrupadas ukhamaraki clasificadas en endoplasias especializadas Net salida sitio, ukaxa mayjawa kunatixa apnaqata proteínas transmembrana ukanakampi. Ukhamaraki, uñacht’ayapxaraktwa cadena de ceramida ukaxa membrana retículo endoplásmico uksanxa wali wakiskiriwa aka selectividad de clasificación ukatakixa. Jiwasana yatxatawixa nayrïri directa evidencia in vivo uñacht’ayiwa cargas proteicas ukanakaxa cadena lípida ukana largo ukarjamaxa sitios selectivos de exportación ukanakaru vía secretora ukanxa clasificañataki.
Células eucariotas uksanxa, proteínas sintetizadas retículo endoplásmico (ER) uksanxa, ukxaruxa uñakipatarakiw transporte uksanxa vía secretora tuqi ukhamata puriyañataki aka destino celular apropiado uksaru (1). Ukhamaraki, clasificación mediada por capa, ukaxa nayra pachatpachawa amuyataraki yaqhipa lípidos ukaxa servirakispawa puntos de salida selectivo ukhama agrupación ukampi dominios específicos de membrana ukatxa proteínas específicas (2-5). Ukampirus, waliw jan utjkiti directa evidencia in vivo ukax uñacht’ayañatakix aka mecanismo basado en lípidos ukax utjaspawa. Aka jan walt’awixa askichañatakixa, levadura uksanxa yatxatapxaraktwa kunjamasa proteínas ancladas de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) ukanakaxa diferencialmente ER uksatxa apsutarakiwa. GPI-APs ukaxa kunaymana lípidos ukanakampi chikt’ata células superficiales proteínas ( 6, 7). GPI-AP ukaxa mä proteína secretada ukawa, ukaxa membrana plasmática uksana anqäxa folletos ukanakaru uñtatawa, ukaxa fracción glicolípida (ancla GPI) tuqi. Jupanakax anclaje GPI ukarux modificaciones post-traduccionales conservadoras ukham katuqapxi, lumen ER ukanx (8). Uka apthapiwi tukuyatatxa, GPI-AP ukaxa aparato Golgi (5, 9) uksa tuqita ER uksatxa membrana plasmática uksaruwa pasaraki. Aka anclajes GPI ukanaka utjatapaxa GPI-AP ukaxa sapa mayniru puriyatarakiwa proteínas secretadas transmembrana (ukaxa yaqha proteínas de membrana plasmática ukanakampi) secretora thakhi tuqiru (5, 9, 10). Aka celulas de levadura uksanxa, GPI-APs ukaxa yaqha proteínas secretadas ukanakatxa jaljatarakiwa retículo endoplásmico uksana, ukxaruxa envasados ​​ukhamawa vesículas únicas ukanakaru envuelta complejo proteico de capa II (COPII) (6, 7). Aka determinantes aka proceso de clasificación ukaxa proceso de exportación ER uksanxa janiwa qhanakiti, ukampisa amuyatarakiwa aka mecanismo ukaxa lípidos uksa munaspawa, juk’ampirusa remodelación estructural de la porción lípida del ancla GPI (5, 8). Levadura uksanxa, remodelación de lípidos GPI ukaxa qalltasiwa jank’aki GPI uksa tuqita, ukatxa walja kutixa, ceramida uksa tuqiruxa 26 carbono uksaruwa ch’amancharaki ácido graso saturado de cadena larga (C26:0) (11, 12). C26 ceramida ukaxa nayraqata ceramida ukawa, ukaxa células de levadura ukanakampi luratawa. Ukaxa sintetizada ER uksana ukatxa jilpachaxa aparato Golgi uksaruxa vesículas COPII tuqiwa apsutaraki (13). Aka ER exportación de GPI-AP específicamente ukaxa wakisiwa síntesis de ceramida ukaxa sarantaski (14, 15), ukatxa, turkakiptawixa ceramida ukatxa ceramida de fosfato inositol (IPC) ukjamaraki aparato Golgi uksanxa depende de síntesis de anclaje GPI (16). Yatxatawi biofísica membranas artificiales ukanakampixa uñacht’ayiwa wali jaya cadena acil ceramidas ukanakaxa mayachasipxaspawa dominios ordenados ukanaka lurañataki propiedades físicas ukanakampi (17, 18). Aka yatxatawixa hipótesis ukaru puriyi, ceramida C26 ukatxa GPI-AP ceramida C26 ukampixa propiedades físicas ukanaka apnaqapxi, ukhamata mayachañataki ordenadas regiones jan ukaxa regiones ukanakaru aka medio ambiente lípido de membrana ER relativamente desordenada ukanxa. Jilapachaxa jisk’a ukhamaraki insaturados glicerolípidos (C16:1 y C18:1) ukanakampiwa lurataraki (19, 20). Aka suyunakaxa selectivamente uñakipatarakiw sitios específicos de salida ER (ERES), kawkhantixa ceramida ukhamaraki GPI-AP basado en ceramida ukaxa co-transportadas ukhamawa Golgi ukaru pachpa dedicada vesícula COPII (5).
Aka yatxatawinxa, chiqapa yant’apxaraktwa aka mecanismo basado en lípidos ukaxa microscopía de imagen confocal en tiempo real super-resolución (SCLIM) ukampiwa lurataraki, ukaxa mä técnica de microscopía de punta ukawa, ukaxa mä pachana uñjasispawa proteínas etiquetadas fluorescente ukanakampi Aka kimsa color ukhamaraki kimsa dimensional (3D) uñacht’awinakaxa wali jach’a resolución ukhamaraki velocidad ukaniwa jakaña células ukanxa (21, 22).
Nayraqatax tecnología SCLIM ukampiw apnaqapxta, ukhamat juk’amp qhanañchañataki kunjams normal GPI-AP ukax C26 ceramida qutumpi uñakipatax proteínas secretadas transmembrana ukanakat ER uksat mistuñ tukuyatat S. cerevisiae uksan. Ukhamarusa, ER ukan clasificación uñakipañatakixa, mä sistema genético ukampiwa lurataraki, ukaxa chiqapa uñjasispawa machaq sintetizado carga ERES ukar mantañapataki in vivo (7, 23). Cargo ukhama, ajlliwaytanwa C26 ceramida basada GPI-AP Gas1 etiquetada proteína fluorescente verde (GFP) ukhamaraki proteína secretada transmembrana Mid2 etiquetada proteína fluorescente cercano infrarrojo (iRFP), ukaxa panpachawa membrana plasmática ukaru uñtatawa (24–26). Aka mutante sec31-1 temperatura-sensible uksanxa, aka pä cargas ukanakaxa uñacht’ayatarakiwa mä promotor inducible a galactosa ukhamaraki mä marcador ERES constitutivo ukanakampi. Aka extrema temperatura (37°C), kunatixa mutación sec31-1 ukaxa afectarakiwa función del componente de capa COPII Sec31 ukaxa jark’aqañataki germinación COPII ukhamaraki exportación ER, machaq carga sintetizada ukaxa tantachasi ER uksana (23). Ukatxa, mä jisk’a temperatura (24°C) ukjamaru thayt’ayasaxa, células mutantes sec31-1 ukaxa área secretora uksatxa kutt’ayatarakiwa, ukatxa machaq carga sintética acumulada ukaxa ER uksatxa apsuñ qalltaraki. CLIM uñacht’ayawixa uñacht’ayiwa jilpacha jichha sintetizado Gas1-GFP ukhamaraki Mid2-iRFP ukaxa wali tantachatawa ER de las células mutantes sec31-1 ukjamaraki incubación 37 °C ukjamaraki 24 °C 5 minutos ukjamaru apsutarakiwa (Figure 1). Kunjamatixa Mid2-iRFP ukaxa taqpacha membrana ER uksana jaljatawa, ukatxa Gas1-GFP ukaxa concentrada ukhamaraki apthapitawa área de membrana ER discontinua uksana, ukatxa jaljawixa taqpacha mayjawa (Figure 1, A a C y Película S1). Ukhamaraki, kunjamatixa 1D uñacht’ayata, cluster Gas1-GFP ukaxa janiwa Mid2-iRFP ukampikiti. Aka yatxatawixa uñacht’ayiwa GPI-AP ukatxa proteínas transmembrana ukaxa kunaymana regiones de membrana ER ukanakaru nayraqata jaljata. Aka clúster Gas1-GFP ukaxa jak’ankiwa mä específico ERES ukarjama etiquetado ukhamaraki mCherry’s COPII proteína capa Sec13 (Figure 1, E y F, y película S1) (23).
sec31-1 celulas ukaxa uñacht’ayiwa secreciones inducidas por galactosa, mä larga cadena acil (C26) ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ch’uxña) ukhamaraki proteína transmembrana Mid2-iRFP (TMP, azul) ukatxa aka Constructivo ERES etiquetado Sec13-mCherry (ERES, magenta) ukaxa incubada 37 °C 30 minutos, ukjamaraki 24°C, ukatxa SCLIM ukampiwa 5 minutos ukjata uñacht’ayata. (A a C) uñacht’ayiwa mä representativa fusionada jan ukaxa sapa 2D uñacht’awi mä plano (A), mä proyección 2D uñacht’awi 10 z-secciones (B) jan ukaxa mä 3D hemisferio celular uñacht’awi carga ukhamaraki marcadores ERES (C). Barra de escala 1μm (A ukatxa B). Uka unidad de escala ukaxa 0,551μm (C) ukjawa. Gas1-GFP ukaxa jikxatasiwa discretas regiones ER jan ukaxa clústeres ukanakana, ukatxa Mid2-iRFP ukaxa uñakipatarakiw taqpacha membrana ER (C) uksana. (D) Aka gráfico ukanxa uñacht’ayatawa intensidad relativa de fluorescencia Gas1-GFP ukhamaraki Mid2-iRFP ukanakaxa clúster Gas1-GFP ukanxa janq’u flecha línea (ch’iqa) tuqiru. AU, unidad arbitraria ukaxa. (E ukat F) ukax 3D uñacht’ayi, ukax aski yänakampi ERES chimpumpiw mayachthapi. Aka clústeres Gas1-GFP ukaxa ERES específico jak’anwa uñakipata. Uka unidad de escala ukaxa 0,551μm ukjawa. (F) Janq’u flecha sólida ukaxa clúster Gas1-GFP ukampi ERES ukampiwa chikañchasi. Chika taypi ukhamaraki kupi paneles ukanakaxa uñacht’ayiwa mayachata jach’aptayata 3D uñacht’awi ukhamaraki mä turkata uñakipata ajlliri clúster Gas1-GFP.
Uka jak’a espacial clúster Gas1-GFP ukampi mä específico ERES ukampixa uñacht’ayiwa Gas1-GFP ukaxa ERES selectivo ukarux mantaspawa, ukaxa mayjawa selectividad ukampi Mid2-iRFP ukampi ER ukata mistuñataki. Uka lurawi askichañatakixa, mä jan ukaxa pä yänakatakikiwa ERES uksa tuqita jakhthapita (Figure 2, A a C). Jilapart ERES (70%) ukax mä kasta carga ukakiw utji sasaw jikxatapxta. Aka 2C uñacht’awixa pä uñacht’awi típico uñacht’ayiwa ERES ukampi Gas1-GFP ukampi (1 uñacht’awi) jan ukaxa Mid2-iRFP ukampi (2 uñacht’awi). Ukampirus niya 20% ERES ukax pä carga ukaniwa, ukax pachpa chiqanw ch’amanchasi. Uñakipatarakiw yaqhip ERES (10%) ukax pä kasta carga ukaniwa, ukampis qhana mayj mayj chiqanakanw saparst’ata. Ukhamarusa, aka análisis estadístico ukaxa uñacht’ayiwa ER uksa tuqita apsutaxa, GPI-AP Gas1-GFP ukatxa carga transmembrana Mid2-iRFP ukaxa kunaymana ERES ukanakaru jaljatawa (Figure 2D). Aka eficiencia de clasificación ukaxa wali sumawa nayra análisis bioquímico (6) ukhamaraki determinación morfológica (7) ukanakampi. Ukhamaraki, ERES ukar mantañ carga cuarentena ukan sarnaqawip uñjaraksnawa (Figure 2E y Película S2). Figura 2E ukanxa uñacht’ayatawa mä jisk’a chiqa Gas1-GFP (panel 3) jan ukaxa Mid2-iRFP (panel 4) ukanakaxa mä ladu tuqita ERES uksaru mantaraki ukatxa mä área discreta uksanwa jist’antata. Panel 5 de la figura 2E uñacht’ayiwa Gas1-GFP ukatxa Mid2-iRFP ukaxa yaqhipa pachaxa pachpa ERES uksanwa jikxatasi, ukampisa kunaymana tuqinakatwa mantapxi ukatxa sapaqata suyunakanxa concentradas ukanakaxa inasa mayja vesículas COPII ukanaka uñacht’aychispa. Ukhamaraki, chiqapawa uñjata separación ukhamaraki clasificación de GPI-AP Gas1 basada en ceramida C26 como ERES selectivo ukaxa específica ukhamawa kunatixa yaqha carga de secreción transmembrana, ukaxa GFP-etiquetado proteína de membrana plasmática Axl2 (27 ), uñacht’ayiwa uñtasita sarnaqawi Mid2-iRFP. (S1 uñacht’äwi ukat S3 uñacht’äwi). Aka machaq sintetizado Axl2-GFP ukaxa membrana ER tuqiwa Mid2-iRFP ukjamaraki (Figure S1, A y B), ukjamaraki co-localizado Mid2-iRFP ukjamaraki jilpacha ERES uksana (Figure S1, B a D). Paneles 1 y 2 de la Figura 1. S1C uñacht’ayiwa pä típico uñacht’awi ERES ukanxa pä carga transmembrana ukanakaxa uñakipatawa. Uka tuqinakanxa, panpacha yänakaxa ERES ukarux mayakiw mantapxi (Figure S1E, Panel 3 y Película S3).
Aka sec31-1 celulas expresadoras secreciones inducibles de galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ch’uxña) ukhamaraki Mid2-iRFP (TMP, azul) ukhamaraki etiquetado constitutivo ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) ukanakaxa 37 ukjaruwa uchataraki 30 minutos ukjamaru incubadas a °C, ukxaruxa 24 °C ukjamaru apsutarakiwa bloque de secreción uksa apsuñataki, ukatxa imagen SCLIM ukampi luratarakiwa 20 minutonaka. (A a C) Uñacht’awinaka proyección 2D (A; barra de escala, 1μm) jan ukaxa 3D hemisferio celular (B y C; unidad de escala, 0,456μm) ukjamaraki carga ukatxa 10 z-secciones ukanakaxa ERES ukampiwa chimpuntata. Panel inferior (B) ukatxa panel (C) ukanxa uñacht’ayiwa lurawi uñacht’awinaka uñacht’ayañataki kunatixa utjki uka yänakaki ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) ukhamaraki Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Flecha abierto: ERES ukax mä carga (1 ukat 4) ukakiw apti. Flecha gris: ERES ukax carga segregada ukaniwa (5). Janq’u flecha sólida: ERES ukax carga co-ubicación ukaniwa. Aka amparampi: Ajllita sapa ERES ukaxa Gas1-GFP (1) jan ukaxa Mid2-iRFP (2) ukanakampikiwa. Barra de escala, ukaxa 100 nm. (D) Fotomicrografía ukana (C) ukanxa qhananchatawa. Uka promedio porcentaje de ERES ukaxa mä carga (Gas1-GFP jan ukaxa Mid2-iRFP), carga segregada ukatxa carga superpuesta ukampi. Kimsa independiente yant’awina, n=432 54 celulas uksana. Pantjasiwi barra = SD. Pä chuyma jan pari t yant’awi. *** P = 0,0002 ukjawa. (E) 3D uñacht’awi ajlliri ERES ukatxa carga cuarentenada ukatxa (C) chimpuntata. Gas1-GFP (ch’uxña) (3) jan ukax Mid2-iRFP (azul) (4) ukax mä chiqat ERES (magenta) uksaruw mantani ukatx ERES uksanx mä jisk’a chiqaruw jark’ata. Awisaxa, panpacha kasta carga ukanakaxa pachpa ERES (5) ukarux pachpa chiqatwa mantapxi, ukatxa ERES ukanxa mä sapa chiqaru jist’antatawa. Barra de escala, ukaxa 100 nm.
Ukxarusti, mä hipótesis yant’apxaraktwa, aka ceramida de cadena acil larga (C26) ukaxa membrana ER uksankiwa, ukaxa agrupación específica ukhamaraki clasificación de Gas1 uksa ERES selectivo uksaru irpxaruwayi. Uka lurañatakixa, mä cepa de levadura modificada GhLag1 ukampi luratarakiwa, ukanxa pä sintasas ceramida endógenas Lag1 ukatxa Lac1 ukaxa GhLag1 (homólogo Lag1 de algodón) ukampiwa turkata, ukatxa mä cepa de levadura ukaxa mä cepa de membrana celular Ceramida ukampi jisk’akiwa sallqa kastat sipansa (Figure 3A) (28). Análisis de espectrometría de masas (MS) ukjamaraki cepas de tipo salvaje uksanxa, 95% ukja ceramida taqpachaxa wali jach’a (C26) cadena ceramida ukjamaraki GhLag1 uksanxa, 85% ukja ceramida ukjamaraki wali jach’a (C18 y C16). ), 2% ukja ceramida ukjamaraki wali jach’a (C26) cadena ceramida ukjamaraki. Ukhamaraki, C18 ukhamaraki C16 ceramidas ukaxa nayraqata ceramidas uñakipata membrana GhLag1 uksanxa jichhakamaxa, análisis MS ukaxa chiqapawa ancla GPI de Gas1-GFP expresada en la cepa GhLag1 ukaxa ceramida C26 ukampi chikachasiñawa, ukaxa lípidos de tipo salvaje ukanakampi chikachasiñawa. Uka suma qhananchawixa pachpakiwa (Fig. 3A) (26). Ukhamarusa, akaxa sañ muniwa aka enzima remodelación de ceramida Cwh43 ukaxa wali selectiva ukhamawa ceramida C26 uksa tuqita, kunjamatixa uñacht’ayata aka 26 uñacht’awina, ukaxa wali sumawa ancla GPI uksa tuqita mä jisk’a ceramida C26 uksa tuqita aka cepa GhLag1 uksana. S2 (29) ukat juk’ampinaka. Ukhampachasa, membrana celular GhLag1 ukaxa básicamente C18-C16 ceramida ukampikiwa, ukatxa Gas1-GFP ukaxa wali C26 ceramida ukampi. Aka chiqapaxa aka cepa ukaxa mä herramienta ideal ukhamawa específicamente askichañataki problema de la longitud de la cadena acil de la ceramida de membrana en el ER. Uka hipotético rol de clase ukatxa clasificación. Ukxarusti, nayraqata yatxatapxaraktwa kunjamasa C26 Gas1-GFP ukaxa tantachasi clústeres ukanakana GhLag1 uksanxa mä alelo mutante sensible temperatura sec31-1 ukampi microscopía convencional de fluorescencia tuqi, kawkhantixa jaya (C18-C16) cadena ukaxa utjiwa Ceramida de membrana ER uksana (Fig. 3). Jiwasaxa uñjtanwa sec31-1 uksanxa, jilpacha Gas1-GFP ukaxa clústeres uksanwa concentrada, ukatxa Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 uksanxa jaya (C18-C16) largo ceramida membrana ER uksanxa jilpachaxa janiwa agrupadas ukhamaraki distribuidas en In the toda la membrana ER. Chiqpachansa, kunatixa agrupación basada en ceramida C26 ukaxa wali jak’akiwa ERES específico ukampi (Figure 1), ukxaruxa yatxatapxaraktwa aka lurawixa inasa ukhamaraki función del mecanismo proteico de exportación ER ukampi. GPI-AP ukaxa mä sistema especial COPII ukampi ER exportación ukatakixa apnaqi, ukaxa activamente regulado ukhamawa Ted1′s remodelación estructural ukampi aka porción glicano ukampi aka ancla GPI (30, 31). Ukxarusti GPI-glicano recombinante ukaxa uñt’atarakiwa complejo receptor de carga transmembrana p24 ukampi, ukaxa turkakiptawimpixa selectivamente recluta Lst1, ukaxa mä isoforma específica de la subunidad de unión carga COPII mayor Sec24, formando una GPI-AP-riqueza COPII Vesículas ukaxa wakisiwa (31-33). Ukhamarusa, lurapxaraktwa mä doble mutante ukaxa mayachatarakiwa deleción uka sapa proteínas (componente complejo p24 Emp24, enzima remodelación GPI-glicano Ted1 ukatxa subunidad específica COPII Lst1) ukampi sec31-1 cepa mutante ukampi, ukatxa yatxatatarakiwa Is it possible to form Gas1-cluster GFP (Figure 3). Jiwasaxa uñjtanwa sec31-1emp24Δ ukhamaraki sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ukaxa jilpachaxa jani agrupada ukhamaraki jaljata taqpacha membrana ER uksana, kunjamatixa nayraqata uñjata sec31-1 GhLag1 uksana, ukatxa sec31-1lst1Δ uksanxa, Gas1-GFP Kunjamatixa sec31-1. Aka lurawixa uñacht’ayiwa aka ceramida C26 ukjamaraki membrana ER uksana utjatapatxa, agrupamiento de Gas1-GFP ukaxa wakisirakiwa complejo p24 uksaru ligado, ukatxa janiwa reclutamiento específico Lst1 ukaxa wakiskiti. Ukxarusti, yatxatapxaraktwa kunjamasa cadena de ceramida ukaxa membrana ER uksanxa Gas1-GFP uksa tuqita p24 uksa tuqiru uñtawixa regulaspa. Ukampirusa, jikxatawayapxaraktwa aka ceramida C18-C16 uksa tuqita membrana uksanxa janiwa GPI-glicanos reconstruidos por el complejo p24 (Figures S3 y S4, A y B) jan ukaxa GPI-AP uksaru ligado ukhamaraki exportación GPI-AP uksa tuqiruxa jan walt’aykiti. maña. Reclutamiento COPII subtipo Lst1 (S4C uñacht’awi). Ukhamarusa, agrupación dependiente de ceramida C26 ukaxa janiwa interacciones proteicas ukaxa munaskiti kunaymana mecanismos proteicos de exportación ER ukanakampi, jan ukasti mä mecanismo de clasificación alternativo ukarux yanapt’arakiwa, ukaxa lípidos largo ukampiwa irpata. Ukxarusti, uñakipapxaraktwa aka cadena de acil de ceramida ukaxa membrana ER uksanxa wali askiwa aka clasificación efectiva de Gas1-GFP ukjamaraki ERES selectivo ukhama. Niyakixay Gas1 cepa GhLag1 ukampi ceramida de corta cadena ukampixa ER uksatxa mistu ukatxa membrana plasmática uksaru mantawaychixa (Figure S5), jiwasaxa amuyaraktanwa, aka clasificación ukaxa cadena acil de ceramida uksa tuqita jaya pachana irpata, ukaxa Gas1 cepa GhLag1 uksanxa redireccionatarakispawa ukhamaraki cruzada. ERES yänakaxa pachpa membrana ukampiwa lurataraki.
(A) Membrana celular GhLag1 uksanxa jilpachaxa ceramidas C18-C16 uksa jisk’akiwa, ukatxa ancla GPI Gas1-GFP uksanxa wali pachpa C26 IPC ukjamaraki células de tipo salvaje ukanakampi. Aka pata tuqina: análisis de longitud de cadena acil ceramida uksana membrana celular uksana cepas de tipo salvaje (Wt) ukhamaraki GhLag1p uksana espectrometría de masas (MS) tuqi. Uka yatxatawixa sapa patakata taqpacha ceramida uksa tuqita uñacht’ayi. Kimsa independiente yant’awinakatxa chika taypinkiwa. Pantjasiwi barra = SD. Pä chuyma jan pari t yant’awi. **** P <0.0001 ukhawa. Panel inferior: Análisis MS de la longitud de la cadena acil de la IPC ukanxa ancla GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) ukanxa uñacht’ayatawa cepas de tipo salvaje ukhamaraki GhLag1p ukanakampi. Uka yatxatawixa sapa patakata taqpacha IPC señal uñacht’ayi. Promedio phisqa independiente yant’awinaka. Pantjasiwi barra = SD. Pä chuyma jan pari t yant’awi. ns, janiw wakiskirïkiti. P = 0,9134 ukjawa. (B) Fluorescence micrographs of sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ and sec31-1lst1Δ cells expressing galactose-induced Gas1-GFP were incubated at 37°C for 30 minutes and passed down to Perform routine fluorescence microscopy after 24°C ukharu. Janq’u flecha: ER Gas1-GFP ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. Flecha abierto: Gas1-GFP jan agrupado ukaxa taqpacha membrana ER uksana jaljatawa, uñacht’ayiwa tinción anillo nuclear característica ER. Barra de escala, 5μm. (C) Cuantificación de la fotomicrografía ukaxa (B) ukanxa qhananchatawa. Ukasti sapa patakata celulanakaxa puntuada Gas1-GFP ukanakampiwa lurataraki. Kimsa independiente yant’awinakanxa, n≥300 celulas. Pantjasiwi barra = SD. Pä chuyma jan pari t yant’awi. **** P <0.0001 ukhawa.
Aka jan walt’awi chiqapa askichañatakixa, lurapxaraktwa SCLIM visualización Gas1-GFP ukhamaraki Mid2-iRFP GhLag1 ukampi sec31-1 temperatura-sensible alelo mutante (Figure 4 y Película S4). Uka ER ukaxa 37 °C ukjamaru katxaruta ukatxa ukxaruxa 24 °C ukjamaru apsutarakiwa, jilpachaxa jichha sintetizado Gas1-GFP ukaxa janiwa agrupada ukhamaraki distribuida taqpacha membrana ER uksana, kunjamatixa uñjasi microscopios convencionales ukanakampi (Figure 4, A y B ). Ukhamaraki, mä jach’a sapa patakata ERES (67%) ukanxa pä kasta carga ukanakawa co-localizado ukanxa (Figure 4D). Paneles 1 ukatxa 2 ukanakaxa Figura 4C ukanxa pä típico uñacht’awinaka ERES uñacht’ayiwa Gas1-GFP ukhamaraki Mid2-GFP ukanakampi. Ukhamaraki, panpacha yänakaxa pachpa ERES uksaruwa apthapita (Figure 4E, panel 3 y película S4). Ukhamarusa, jiwasana lurawinakasaxa uñacht’ayiwa aka cadena acil ceramida ukaxa membrana ER uksanxa mä wakiskir determinante ukhamawa agregación ukhamaraki clasificación proteica ER uksa tuqita.
Sec31-1 GhLag1 celulas expresadoras secreciones inducidas por galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, ch’uxña) ukhamaraki Mid2-iRFP (TMP, azul) ukhamaraki constitutiva ERES-etiquetado Sec13-mCherry (ERES, magenta) Incubadas a 37 °C. Ukhama 30 t’ijturjama sarantayaña, 24 °C ukjamaru jaqukipaña secreciones ukanaka apsuñataki, ukatxa SCLIM ukampiwa 20 t’ijturjama uñacht’ayaña. (A a C) Representantes uñacht’awinaka proyección 2D (A; barra de escala, 1μm) jan ukaxa 3D hemisferio celular uñacht’awinaka (B ukhamaraki C; unidad de escala, 0,45μm) 10 z-secciones ukanakaxa carga ukhamaraki ERES ukanakampi chimpuntata. Panel inferior (B) ukatxa panel (C) ukanxa uñacht’ayiwa lurawi uñacht’awinaka uñacht’ayañataki kunatixa utjki uka yänakaki ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) ukhamaraki Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Janq’u phuqt’ata flecha: ERES, yänakaxa ch’amanchatawa. Jisk’a flecha: ERES ukax mä yäkiw utji. Panel inferior: ERES ajllitaxa aski yänaka (1 ukatxa 2) uñakipatawa (C). Barra de escala, ukaxa 100 nm. (D) Fotomicrografía ukanxa (C) ukanxa qhananchatawa. Aka unidades sec31-1 ukhamaraki sec31-1 GhLag1 uksanxa, mä carga (Gas1-GFP jan ukaxa Mid2-iRFP) ukakiw uñakipata, ukatxa promedio porcentaje de ERES ukaxa carga aislada ukatxa carga superpuesta ukataki. Kimsa independiente yant’awina, n = 432 54 celulas (sec31-1) ukhamaraki n = 430 47 celulas (sec31-1 GhLag1). Pantjasiwi barra = SD. Pä chuyma jan pari t yant’awi. *** P = 0,0002 (sec31-1) ukjamaraki ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1) ukjamaraki. (E) 3D uñacht’awi ERES ajllitanakampi carga superpuesta (3) ukampiwa (C) chimpuntata. Gas1-GFP (ch’uxña) ukhamaraki Mid2-iRFP (azul) ukanakaxa ERES (magenta) uksa tuqiru jak’achasipxi ukatxa pachpa ERES jark’ata chiqana qhiparapxi. Barra de escala, ukaxa 100 nm.
Aka yatxatawixa directa in vivo uñacht’ayiwa cargas proteicas basadas en lípidos ukanakaxa clasificados ukhamawa sitios selectivos de exportación ukanakana secretora thakhi tuqina, ukatxa uñacht’ayiwa kunjamasa cadena acil ukaxa wali wakiskirixa selectividad clasificación ukatakixa. Mä ch’amani ukhamaraki de punta técnica microscopía SCLIM sata apnaqasa, uñacht’ayapxaraktwa jichha sintetizada Gas1-GFP (mä jach’a membrana plasmática GPI-AP ukampi mä muy larga cadena acil (C26) ceramida porción lípida) levadura uksana ) Aka regiones agrupadas en ERs discretos ukanakaxa ERES específicas ukanakampiwa chikañchasi, ukatxa proteínas secretadas transmembrana ukanakaxa taqpacha membrana ER uksanwa jaljataraki (1 uñacht’awi). Ukhamaraki, aka pä kasta yänakaxa mayja mayja ERES ukarux ajllisaw mantapxi (2 uñacht awi). Aka ceramida celular uksanxa cadena acil uksa tuqita membrana uksanxa C26 uksatxa C18-C16 uksaruwa jisk’achataraki, aka clúster Gas1-GFP uksa tuqiruxa ch’amanchatarakiwa región discreta ER uksa tuqiru, ukatxa Gas1-GFP uksa tuqiruxa mayjt’ayatarakiwa ER uksatxa mistuñataki aka proteína transmembrana ukampi pachpa ERES tuqi (Figure 3 y Figura 3). 4).
Ukhamaraki, GPI-AP ukaxa mä mecanismo proteico especializado ukampi ER uksatxa mistuñatakixa, jikxatawayapxaraktwa separación dependiente de la ceramida C26 ukaxa janiwa interacciones proteicas diferenciales ukanakaruxa atinisiñakiti ukaxa inasa especialización ERES uksaru puriyaspa (Figures S4 y S5). Ukhamakipansti, jiwasan yatxatawinakax mä mecanismo de clasificación alternativo ukarux yanapt’iwa, ukax agrupación proteica basada en lípidos ukampiw irpata ukatx qhiparux yaqha cargas ukanakar jaqukipata. Jiwasana uñjawinakaxa uñacht’ayiwa aka región Gas1-GFP jan ukaxa clúster asociado a un específico ERES ukaxa janiwa utjkiti proteína secretada transmembrana Mid2-iRFP, ukaxa uñacht’ayiwa aka clúster GPI-AP dependiente de la ceramida C26 ukaxa facilitará la entrada a la ERES relevante, ukatxa pachpa pachana, excluye transmembrana Uka secreciones ukaxa mantiwa aka particular ERES (Figures 1 y 2). Uka kipkaraki, ceramidas C18-C16 ukanaka utjatapaxa membrana ER uksanxa janiwa GPI-AP ukaxa regiones jan ukaxa clústeres ukanaka lurañatakixa luraskiti, ukhamarusa janiwa jaqukipapkiti jani ukaxa lantintapkiti proteínas secretadas transmembrana uksa tuqita pachpa ERES uksaru (Figures 3 y 4). . Ukhamarusa, ceramida C26 ukaxa separación ukhamaraki clasificación uksaruwa irpxaruwayi, ukaxa facilitación de agrupación de proteínas ligadas a ERES específicos ukanakampiwa.
Kunjamas aka C26 ceramida-dependiente clustering ukax mä específica área ER ukar purispa? Aka tendencia ceramida de membrana uksa tuqita lateralmente jaljañatakixa lurasirakispawa GPI-AP ukatxa C26 ceramida uksa tuqita jisk’a ukhamaraki instantáneamente ordenada lípidos uksa tuqita juk’ampi irregular medio ambiente lípido uksana membrana ER uksanxa juk’ampi jisk’a ukhamaraki insaturados glicerolípidos ukanakampi. Clusters de calidad (17, 18) ukat juk’ampinaka. Aka jisk’a pacha ch’uqi ch’uqixa juk’ampi ch’amanchatarakispawa jach’a, juk’ampi ch’amanchata ch’uqi ch’uqimpi, ukatxa complejo p24 ukampi chikt’ata (34). Ukampi chika, uñacht’ayapxaraktwa C26 Gas1-GFP ukaxa wakisiwa chikañchasiña complejo p24 ukampi juk’ampi jach’a uñjkaya clústeres ukanaka lurañataki (3 uñacht’awi). Aka complejo p24 ukaxa mä oligómero heterocigómero ukjamaraki pusi kunaymana proteínas transmembrana p24 ukjamaraki levadura (35), ukaxa churarakiw unión multivalente, ukaxa puriyaspawa reticulación jisk’a clústeres GPI-AP, ukhamarusa lurasirakispawa jach’a clúster Estable (34). Ukhamaraki, aka interacción ectodominios proteicos GPI-APs ukaxa yanapt’arakispawa agregación ukaru, kunjamatixa uñacht’ayata aka transporte de Golgi ukaxa células epiteliales polarizadas mamíferas ukanakana (36). Ukampirusa, kunapachatixa ceramida C18-C16 ukaxa membrana ER uksana utjki ukjaxa, kunapachatixa complejo p24 ukaxa Gas1-GFP uksaru ligado ukjaxa, jach’a sapaqata clústeres ukanakaxa janiwa utjkaniti. Uka mecanismo subyacente ukaxa propiedades físicas ukhamaraki químicas específicas ukanakatxa dependerá de la larga cadena acil ceramida. Yatxatawi biofísica membranas artificiales ukanakatxa uñacht’ayiwa, jani ukaxa jaya (C24) ukhamaraki jisk’a (C18-C16) ceramidas de cadena acil ukanakaxa separación de fase ukanaka lurarakispawa, ukampirusa ceramidas de cadena acil larga (C24) ukanakakiw jach’a Curvatura ukhamaraki película flexión ukanakaru ch’amanchaspa película ukar mayjt’ayañataki. Maynit maynikam uñakipt’asisaw (17, 37, 38). Uñacht’ayatarakiwa aka hélice transmembrana de TMED2, homólogo humano de Emp24, ukaxa selectivamente interactúa esfingomielina basada en ceramida C18 ukampi aka lóbulos citoplasmáticos (39). Simulaciones de dinámica molecular (MD) ukampixa, jikxatawayapxaraktwa ceramidas C18 ukhamaraki C26 ukanakaxa lóbulos citoplasmáticos ukanaka muytaparu tantachasipxi aka hélice transmembrana Emp24 uksana, ukatxa jupanakaxa pachpa munañanakaniwa (Figure S6). Akaxa uñacht’ayiwa aka hélice transmembrana de Emp24 ukaxa puriyaspawa distribución asimétrica de lípidos ukanaka membrana uksana. Akax jichhakiw mä resultado ukhamawa, ukax células mamíferas ukanakat uñakipatawa. Ukhamaraki simulaciones MD ukanakaxa uñacht’ayatarakiwa lípidos éter ukanaka utjatapa (40) . Ukhamarusa, ceramida C26 ukaxa pä lóbulo ER26 uksanxa localmente riqueza ukhamawa sasina amuyt’apxtanxa. Kunawsatixa GPI-AP ukaxa lóbulos luminales uksanxa chiqapa p24 multivalente uksaru ligado ukhamaraki acumulación de ceramida C26 uksa tuqiru p24 uksa tuqiruxa lóbulos citoplasmáticos uksa tuqiruxa, ukaxa ch’amanchaspawa agregación de Proteína acompañante ukhamaraki curvatura de membrana uksa tuqiruxa luratarakiwa dedos tuqi (41), ukhamarusa GPI-AP ukaxa jaljatarakiwa regiones discretas ukanakaru ERES uksa tuqiru jak’achasiñataki, ukaxa favorecerakiwa aka jach’a curvada uksa tuqiru regiones de la membrana ER (42) ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi. Nayra yatiyawinakax mecanismo propuesto ukaruw yanapt’awayi (43, 44). Aka multivalente uñtawi oligolectinas, patógenos jan ukaxa anticuerpos ukaxa glicosfingolípidos basados ​​en ceramida (GSL) ukanakaru membrana plasmática uksanxa jach’a agregación GSL uksaruwa ch’amancharaki, fase separación uksa ch’amancharaki ukatxa deformación de membrana ukhamaraki internalización uksaruwa puriyaraki (44). Iwabuchi ukjamaraki (43) Uñakipatarakiw jaya (C24) ukampisa janiwa jisk’a (C16) cadenas acil ukanakana utjatapatxa, aka ligando multivalente ligado a la lactosilceramida GSL ukaxa induce la formación de grandes clústeres y invaginación de membrana, ukatxa transducción de señales mediadas por Lyn citoplasma ukaxa folletos uksanxa interdigitado ukhamawa cadenas acílicas ukanakampi chikt’ata neutrófilos ukanaka.
Aka células epiteliales polarizadas mamíferas uksanxa, concentración de la red anti-Golgi (TGN) ukaxa nivel de membrana plasmática apical uksanxa controla la separación ukhamaraki clasificación de GPI-AP (10, 45). Aka agregación ukaxa oligomerización GPI-AP (36) ukampiwa irpata, ukampisa inasa ukhamaraki depender la cadena de ceramida ukaxa levadura uksana jikxattanxa. Ukhamaraki, GPI-AP mamífero ukaxa mä ancla basada en lípidos éter ukampi, ukatxa estructura química ukaxa wali mayjawa ceramida de cadena acil wali jach’a ukatxa, mä jichha yatxatawixa jikxatasiwa aka panpacha lípidos ukaxa evolutivamente uñtasita propiedades físicas ukhamaraki químicas Ukata función (40). Ukhamarusa, aka lípido éter uksa tuqita celulas mamíferas uksanxa ceramida C26 uksa tuqiru uñtasitawa levadura uksanxa, ukatxa lurawipaxa ceramida de larga cadena ukampiwa membrana uksanxa chikañchasi, ukhamata GPI-AP uksa tantachawi ukhamaraki clasificación uksa ch’amanchañataki. Ukhampachasa aka lurawixa wali chiqapa yant’añawa wakisi, nayra yatxatawinakaxa yanapt’iwa aka transporte de la ceramida de larga cadena acil ukaxa cuerpo Golgi uksaruxa janiwa luraskiti proteínas de transferencia citoplasmática ukampi, jan ukasti síntesis de anclajes GPI ukjamaraki levadura ukjamaraki. Ukhamarusa, mecanismo conservador evolutivo ukaxa selectivamente co-transportar ceramida de cadena acil muy largo ukhamaraki GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ukanakampiwa pachpa vesícula de transporte uksanxa.
Levadura ukhamaraki sistemas celulares epiteliales polarizados mamíferos uksanxa, agregación GPI-AP ukatxa yaqha proteínas de membrana plasmática ukanakatxa jaljawixa taqpachawa lurasi janïra celula pataru puriñkama. Paladino ukat yaqhanakampi. (48) jikxatapxiwa TGN de ​​células epiteliales polarizadas mamíferas uksanxa, agrupación GPI-AP ukaxa janiwa wakiskiti clasificación selectiva de GPI-APs ukatxa membrana plasmática apical ukaru, jan ukasti regula la organización de agrupación de GPI-APs ukatxa Su actividad biológica. Célula uraqina. Levadura uksanxa, aka yatxatawixa uñacht’ayiwa aka clúster GPI-AP dependiente de ceramida C26 ukaxa ER uksanxa regular la organización de clústeres ukhamaraki actividad funcional de GPI-AP en la membrana plasmática (24, 49). Aka modelo ukampi chika, células GhLag1 ukaxa alergicas inhibidores GPI jan ukaxa drogas ukanakaruxa afectarakiwa integridad de la pared celular (28), ukatxa necesidad de clústeres funcionales Gas1-GFP (49) de la ceramida punta proyectada en la apareamiento de células de levadura ukaxa uñacht’ayiwa G Posibles consecuencias fisiológicas de células hLag1. GPI-AP ukax pantjasiwa. Ukampirusa, juk’ampi yant’añatakixa, organizacion funcional de la superficie celular ukaxa programada ukhamawa ER uksatxa mä método de clasificación ukampiwa lípidos uksa tuqita, ukaxa jutïri yatxatawi lurañatakixa wakisirakiniwa.
Aka lurawinxa apnaqata cepas Saccharomyces cerevisiae ukanakaxa Tabla S1 ukanwa uñacht ayata. Aka MMY1583 ukhamaraki MMY1635 cepas de SCLIM ukaxa luratarakiwa células vivas uñakipañatakixa luratarakiwa W303 ukjamaraki. Aka cepas expresadoras Sec13-mCherry ukampi mä etiqueta proteica fluorescente ukampi luratarakiwa mä método basado en reacción en cadena de polimerasa (PCR) ukampi plásmido pFA6a ukampi mä plantilla (23). Aka cepa expresadora Mid2-iRFP etiquetada proteína fluorescente ukampi controlado promotor GAL1 ukampi luratarakiwa aka tuqina. Amplificación PCR de secuencia iRFP-KanMx de vector pKTiRFP-KAN (regalo de E. O’Shea, plásmido Addgene número 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador de recursos de investigación (RRID): Addgene_64687) Ukatxa C-terminal de Mid2 endógeno uksaru uchatarakiwa. Uka secuencia genoma Mid2-iRFP ukaxa amplificada ukatxa clonada ukhamaraki promotor GAL1 ukampi, ukaxa mayachatarakiwa sitio Not I-Sac I ukampi aka plásmido de integración pRS306 ukampi. Aka plásmido pRGS7 ukjamaraki linealizado ukhamaraki Pst I ukjamaraki locus URA3 uksaru mayachañataki.
Aka gen de fusión Gas1-GFP ukaxa uñacht’ayatarakiwa control del promotor GAL1 ukampi aka plásmido centromero (CEN) uksana, ukaxa luratarakiwa aka tuqina. Aka secuencia Gas1-GFP ukaxa amplificada PCR tuqiwa plásmido pRS416-GAS1-GFP (24) (regalo de L. Popolo) ukjamaraki clonada aka sitio Xma I–Xho I ukjamaraki plásmido CEN pBEVY-GL LEU2 (regalo de C) ukjamaraki. Miller jilata; Plásmido de gengen ukaxa 51225 jakhuniwa; http://n2t.net/addgene: 51225 ukat yaqhanakampi; RRID: Ukax mä juk’a pachanakanwa. Uka plásmido apsutaxa pRGS6 satawa. Aka gen de fusión Axl2-GFP ukaxa uñacht’ayatarakiwa control del promotor GAL1 ukampi aka vector pBEVY-GL LEU2 ukampi, ukatxa lurawipaxa akhamawa. Aka secuencia Axl2-GFP ukaxa amplificada plásmido pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ukjamaraki PCR tuqi, ukatxa clonada aka sitio Bam HI-Pst I ukjamaraki vector pBEVY-GL LEU2 ukjamaraki. Uka plásmido apsutaxa pRGS12 sutimpi uñt’atarakiwa. Aka yatxatawinxa oligonucleótidos ukanakan secuenciapaxa Tabla S2 ukanwa uñacht ayata.
Aka cepa ukjamaraki 0,2% adenina ukjamaraki 2% glucosa [YP-dextrosa (YPD)], 2% raffinosa [YP-raffinosa] rico extracto de levadura proteína p (YP) medio (1 % Extracto de levadura y 2% proteína ept) ukjamaraki. (YPR)] or 2% galactose [YP-galactose (YPG)] as a carbon source, or in a synthetic minimal medium (0.15% yeast nitrogen base and 0.5% ammonium sulfate) to supplement appropriate amino acids and bases required for nutrition , And containing 2% glucose (synthetic glucose minimal medium) or 2% galactose (medio mínimo de galactosa sintética) ukjamaraki carbono ukjamaraki.
Chiqapa pacha uñakipañatakixa, células mutantes sec31-1 sensibles a temperatura ukaxa expresa constructo bajo promotor GAL1 ukjamaraki medio YPR uksana 24 °C uksana mä aruma fase media log uksaru. Ukxarusti inducción YPG 24 °C 1 hora ukjamaraki, celulanakaxa incubadas en SG 37 °C 30 minutos, ukxaruxa 24 °C uksaruwa apsutarakiwa bloque de secreción uksatxa mistuñataki. Concanavalina A ukaxa celulanakaxa mä diapositiva de vidrio ukana askichañatakixa apnaqatarakiwa ukatxa SCLIM ukampiwa uñacht’ayataraki. SCLIM ukaxa mä microscopio de fluorescencia invertida Olympus IX-71 ukampi UPlanSApo 100×1.4 lente de aceite de apertura numérica (Olympus), jach’a velocidad ukhamaraki jach’a señal-ruido ratio disco giratorio confocal (Yokogawa Electric), espectrómetro personalizado, ukhamaraki enfriamiento personalizado Uka sisteman intensificador de imágenes (Hamamatsu Fotónica) ukaxa mä sistema de lentes magnificadores ukampi mä qhipa jach’aptayawi ×266,7 ukampi ukhamaraki mä cámara de dispositivos acoplado a carga ukampi ukaxa electrones ukanaka waljaptayi (Hamamatsu Photonics) (21). Imajinanakax software personalizado (Yokogawa Electric) ukampiw lurasi. 3D uñacht’awinakatakixa, mä actuador piezoeléctrico lurata apnaqatarakiwa, ukhamata lente objetivo ukaxa verticalmente ch’allxtañataki, ukatxa 100 nm ukja chiqanakaru mä pila ukanwa apthapita. Aka Z-stack uñacht’awixa 3D voxel ukan yatiyawiparuw jaqukipata, ukatxa función teórica de difusión de puntos ukaxa microscopio confocal disco giratorio ukataki apnaqatarakiwa, ukaxa software Volocity (PerkinElmer) ukampiwa desconvolución lurañataki apnaqataraki. Software Volocity ukampi automáticamente umbral ukar puriñapataki análisis de co-ubicación ukatakixa, ERES ukampi carga ukanakampi chikachasiñawa. Análisis de línea escaneo ukaxa software MetaMorph (Dispositivos Moleculares) ukampiwa lurataraki.
Software GraphPad Prism ukampi chika significación estadística uñakipañataki. Pä chuyma Student’s t-test ukatxa ordinario análisis de varianza de una vía (ANOVA) uka yant’awitakixa, qutu taypina mayjt’awinakaxa P <0,05 (*) ukjaruwa wali jach’a ch’amanchata uñjasi.
Microscopía de fluorescencia de Gas1-GFP ukatakixa, células de fase log ukaxa mä arumawa YPD uksana jiltawayxi ukatxa apthapitawa centrifugación tuqi, pä kutiwa jariqataraki salina tamponada fosfato ukampi, ukatxa incubadas hielo uksana 15 minutos ukjama, ukxaruxa microscopio tuqiwa lurataraki kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata Check (24). Aka microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 aceite PH3 CS) ukaxa mä lente objetivo, filtro L5 (GFP), cámara Hamamatsu ukhamaraki software Application Suite X (LAS X) ukanakampiwa lurataraki. .
Aka muestras ukaxa desnaturalizadas ukhamaraki tampón de muestras SDS 65 °C ukjamaru 10 minutos ukjamaru, ukxaruxa jaljatarakiwa electroforesis de gel SDS-poliacrilamida (PAGE) ukampiwa. Análisis de inmunoblotting ukatakixa, 10 μl de muestra ukjamaraki sapa carril ukjamaraki. Anticuerpo primario: Aka anti-Gas1 policlonal de conejo ukjamaraki dilución 1:3000 ukjamaraki anti-Emp24 policlonal de conejo ukjamaraki dilución 1:500 ukjamaraki anti-GFP policlonal de conejo (mä regalo de H. Riezman) ukjamaraki dilución 1:3000 ukjamaraki. Aka anticuerpo monoclonal anti-Pgk1 de rata ukjamaraki dilución 1:5000 (mä regalo J. de la Cruz) ukjamaraki. Anticuerpo secundario: Peroxidasa de rábano (HRP) conjugada cabra anti-conejo inmunoglobulina G (IgG) ukjamaraki dilución 1:3000 (Pierce) ukjamaraki. Aka HRP-conjugado cabra anti-rata IgG ukjamaraki dilución 1:3000 (Pierce) ukjamaraki. Aka zona de respuesta inmune ukaxa uñjasiwa método de quimioluminescencia ukampiwa reactivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) ukampiwa.
Kunjamatixa (31) ukanxa qhananchata, mä experimento de inmunoprecipitación natural ukjamaraki fracción ER enriquecida ukjamaraki. Mä juk’a arumpixa, celulas de levadura ukaxa tampón TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM flúor de fenilmetilsulfonilo ukhamaraki inhibidor de proteasa mezcla) 600 nm ( OD600) ukjamaraki 100 densidad óptica ukjamaraki pä kuti. Ukajj vidriot lurat perlanakampiw pʼakjatäna, ukatsti celulanakan qʼañunakapasa ukat vidriot lurat perlanakas centrifugación toqew apsutäna. Ukxarusti aka sobrenadante ukxa centrifugada 17.000 g ukjamaraki 15 minutos 4 °C ukjamaru. Aka pellet ukaxa TNE ukjamaraki digitalis saponina ukjamaraki qhipa concentración 1% ukjamawa. Aka suspensión ukxa 1 hora ukjamaraki rotación 4 °C ukjamaraki componentes insolubles ukjamaraki centrifugación ukjamaraki 13.000 g a 4 °C 60 minutos ukjamaraki. Inmunoprecipitación Gas1-GFP uksa tuqita, nayraqataxa nayraqata incubada muestra ukaxa ch’usa perlas de agarosa (ChromoTek) 4 °C 1 hora, ukxaruxa incubada GFP-Trap_A (ChromoTek) 4 °C 3 hora. Aka inmunoprecipitados ukanakaxa phisqa kutiwa jariqataraki TNE ukampiwa 0,2% digoxigenina ukampiwa, eluida tampón de muestra SDS ukampiwa, SDS-PAGE ukjamaraki separadas ukhamaraki inmunoblotting ukampiwa uñakipata.
Kunjamatixa (31) ukanxa qhananchata, determinación de reticulación ukaxa luratarakiwa fracción ER enriquecida ukjamaraki. Mä juk’a pacharuxa, fracción ER enriquecida ukaxa incubada 0,5 mM ditiobis(succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.; 20 °C, 20 min). Aka reacción de reticulación ukjamaraki glicina (50 mM final concentración, 5 minutos, 20 °C) ukjamaraki.
Kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata (50), análisis MS de ceramida ukjamaraki cepas de tipo salvaje ukhamaraki GhLag1 ukanakana luratarakiwa. Mä juk’a arumpixa, celulanakaxa fase exponencial (3 a 4 unidades OD600/ml) ukjamaru YPD ukjamaraki 30 °C ukjamaru jiltayarakiwa, ukatxa 25×107 celulas ukjamawa apthapita. Jupanakan metabolismopax ácido tricloroacético ukamp chhaqtayatawa. Aka disolvente extracción [etanol, uma, éter, piridina ukatxa 4,2 N hidróxido de amonio (15:15:5:1:0,018 v/v)] ukhamaraki 1,2 nmol de calidad interna estándar C17 ceramida (860517, lípido polar Avanti) ukanakampiwa lurataraki. Aka reactivo monometilamina [metanol, uma, n-butanol ukatxa solución de metilamina (4:3:1:5 v/v)] ukjamaraki hidrólisis alcalina llamp’u lurañataki aka extracto ukjamaraki, ukxaruxa n-butanol saturado de agua ukampiwa desaltar. Tukuyañatakixa, extracto ukxa mayampi suspendida disolvente de modo positivo [cloroformo/metanol/uma (2:7:1) + acetato de amonio 5 mM] ukjamaraki inyectada espectrómetro de masas uksaru. Aka multi-reacción monitoreo (MRM) ukaxa luratarakiwa identificación ukhamaraki cuantificación de moléculas esfingolípidas ukanaka. Aka espectrómetro de masa cuadrúpolo terciario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ukaxa mä robótica fuente de iones de nanoflujo Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ukampiwa lurataraki, ukhamata análisis de lípidos ukataki. Uka ch’axwaña ch’amaxa sapa ceramida categoría ukanakatakixa wali sumawa. MS ukan yatiyawipax modo positivo ukan apsutawa. Sapa replicado biológico ukatakixa, señal lípida ukaxa mediana de tres mediciones independientes satawa.
Kunjamatixa (31) ukanxa qhananchata, aka celulas (800×107) ukanakaxa Gas1-GFP ukjamaraki inmunoprecipitación natural ukjamaraki. Aka purificado Gas1-GFP ukjamaraki SDS-PAGE ukjamaraki membrana de flúor de polivinilideno (PVDF) ukjamaraki. Aka proteína ukaxa uñjasiwa PVDF ukampi tinción amida ch’iyarampi. Aka banda Gas1-GFP ukaxa PVDF uksatxa khuchhurata ukjamaraki 5 kutiwa metanol ukjamaraki mä kutixa cromatografía líquida-MS (LC-MS) grado umampi jariqatarakiwa. Aka tira de membrana ukjamaraki 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), tampón ukhamaraki 500μl fresco disuelto 1 M nitrito de sodio ukjamaraki 37 °C ukjamaraki 3 horas ukjamaraki, aka fracción lípida ukjamaraki Gas1-GFP ukjamaraki lisada Liberación de ceramida de fosfato de inosina entre glucosamina y inositol (51). Uka qhipatxa, tira de membrana ukaxa pusi kutiwa jariqataraki LC-MS grado umampi, wañt’ayatarakiwa temperatura ambiente uksana, ukatxa imatarakiwa mä atmósfera de nitrógeno uksana -80 °C uksana análisis uksakama. Control ukjamaraki, sapa yant’awitakixa mä muestra ch’uqi membrana PVDF ukjamaraki apnaqatarakiwa. Ukxarusti Gas1-GFP uksatxa apsuta lípido ukxa MS tuqiwa uñakipata kunjamatixa qhananchata (50). Mä juk’a arumpixa, PVDF tiras ukaxa GPI-lípido ukampi luratarakiwa 75μl disolvente negativo de molde [cloroformo/metanol (1:2) + 5 mM acetato de amonio] ukjamaraki pasatarakiwa ionización electrospray (ESI)-MRM/MS Análisis de especies de esfingolípidos (TSQ Vantage). Uka tuqinxa, MS ukan yatiyawipax iones negativos ukan apsutarakiwa.
Kunjamatixa nayraqata arsuwayktanxa, aka ancla GPI uksanxa lípido uksa tuqita apsutarakiwa [3H]-inositol-etiquetado GPI-AP uksatxa (16). Aka lípidos ukjamaraki cromatografía de capa fina ukjamaraki sistema de disolventes (55:45:10 cloroformo-metanol-0,25% KCl) ukjamaraki FLA-7000 (Fujifilm) ukampiwa uñjasiraki.
Aka celulas expresadoras Gas1-GFP (600×107) ukxa pä kutiwa jariqataraki tampón TNE ukampiwa tampón TNE ukampiwa, ukatxa p’akjatarakiwa perlas de vidrio ukampiwa, ukxaruxa centrifugada ukjamaraki residuos celulares ukhamaraki perlas de vidrio uksa apsuñataki. Ukxarusti aka sobrenadante ukxa centrifugada 17.000 g 1 hora 4 °C. Aka pellet ukxa TNE ukjamaraki 1 U PI-PLC (Invitrogen) ukjamaraki TNE ukjamaraki 0,2% digitalis saponina ukjamaraki 1 hora 37 °C ukjamaru incubada. Aka enzima ukjamaraki tratamiento ukjamaraki membrana ukjamaraki centrifugación ukjamaraki 17.000 g a 4 °C 1 hora ukjamaraki. Gas1-GFP inmunoprecipitación ukatakixa, sobrenadante ukaxa GFP-Trap_A (ChromoTek) ukampiwa 4 °C ukjamaru mä aruma incubada. Aka purificado Gas1-GFP ukjamaraki SDS-PAGE ukjamaraki Coomassie brillante azul ukampiwa ch’amanchataraki. Aka banda de tinción Gas1-GFP ukjamaraki gris ukjamaraki acueducto ukjamaraki alquilación ukjamaraki yodoacetamida ukjamaraki reducción ditiotreitol ukjamaraki digestión in-gel ukjamaraki tripsina ukjamaraki. Extracto ukatxa wañt’ayaña péptidos trípticos ukatxa péptidos ukaxa GPI-glicanos ukanakampi. Aka waña péptido ukaxa 20 μl umampiwa ch’amanchataraki. Mä porción (8μl) ukjamaraki LC ukjamaraki. Aka columna octadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diámetro interno 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura de Aichi, Japón) ukjamaraki péptidos uksa tuqita jaljatarakiwa condiciones específicas de gradiente ukjamaraki. Aka fase móvil ukaxa disolvente A (ácido fórmico 0,08%) ukhamaraki disolvente B (ácido fórmico 0,15% en 80% acetonitrilo) ukanakampiwa lurataraki. Aka sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ukjamaraki columna ukjamaraki disolvente A ukjamaraki 55 minutos ukjamaraki caudal 50 μl min-1 ukjamaraki 5 minutos ukjamaraki concentración de disolvente B ukjamaraki 40% ukjamaraki. , Estados Unidos markanwa). Aka eluado ukaxa sapa kutiwa uñstayataraki aka fuente de iones ESI uksa tuqiru, ukatxa péptidos trípticos ukatxa péptidos GPI-glicanos ukanakampixa uñakipatarakiw LTQ Orbitrap XL (espectrómetro de masas híbridos lineal trampa-orbitrap de iones; Thermo Fisher Scientific). Aka MS ukanxa, voltaje de la fuente capilar ukaxa 4,5 kV ukjamawa, ukatxa temperatura capilar de transferencia ukaxa 300 °C ukjamawa. Aka voltaje capilar ukatxa voltaje de lente tubo ukaxa 15 V ukhamaraki 50 V ukjamawa. Aka MS yatxatawixa apsutarakiwa aka modo iones positivos (resolución 60.000; precisión de masa 10 partes por millón) ukjamaraki mä rango de masa 300/m/z masa/carga (m/z) 3000. Aka MS/MS yatxatawixa apsutarakiwa trampa de iones tuqi LTQ Orbitrap XL [nayrïri 3 dígitos ukatxa datos ukaxa depende, colisión inducida disociación (CID)) ukax mä juk’a pachanakanwa.
Simulaciones MD ukaxa luratarakiwa software GROMACS (52) ukhamaraki campo de fuerza MARTINI 2 (53-55) ukanakampi. Ukxarusti CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ukjamaraki bicapa ukjamaraki dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) ukhamaraki Cer C18 jan ukaxa DOPC ukatxa Cer C26 ukanakampiwa lurataraki. Topología ukhamaraki coordenadas Cer C26 uksa tuqita apsutarakiwa DXCE uksatxa apsutarakiwa extra perlas uksa esfingosina uksa tuqita apsutarakiwa. Aka lurawixa akhamawa qhananchata doble capa ukaru equilibrar ukhamaraki apnaqañataki, ukxaruxa sistema ukatxa qhipa coordenadas ukanakampiwa sistema Emp24 ukampi lurañataki. Aka dominio transmembrana de levadura Emp24 (residuos 173 a 193) ukjamaraki α-hélice ukjamaraki estructura molecular herramienta visual MD (VMD) (58) ukampiwa lurataraki. Ukxarusti, lípidos superpuestos uksa apsuña tukuyatatxa, proteína ukaxa granulado grueso ukjamaraki bicapa uksaru uchatarakiwa CHARMM GUI ukampiwa. Qhipa sistema ukaxa 1202 DOPC ukatxa 302 Cer C26 jan ukaxa 1197 DOPC ukatxa 295 Cer C18 ukatxa Emp24 ukanakampiwa. Aka sistema ukaxa ionizaña mä concentración 0,150M ukjamaru. Pusi replicados independientes ukanakawa lurataraki pä composiciones bicapa ukanakataki.
Aka bicapa lípida ukaxa equilibrada proceso CHARMM GUI ukampi, ukaxa jisk’achatarakiwa ukatxa equilibrar 405.000 pasos, kawkhantixa limitaciones de posición ukaxa juk’ata juk’ata jisk’achatarakiwa ukhamaraki chhaqtayatarakiwa, ukatxa tiempo paso ukaxa jilxatarakiwa 0,005 ps ukjatxa 0,02 ps ukjakama. Equilibración ukxaruxa, 6 μs ukjawa mä pachana 0,02 ps ukjawa. Emp24 ukar uchañ tukuyatatxa, pachpa CHARMM GUI lurawimpiwa sistema ukarux jisk’achañataki ukhamarak equilibrar, ukatx 8 s ukjaw producción ukanx apnaqasi.
Taqi sistemas ukanakatakixa, proceso de equilibrio uksanxa, presión ukaxa barostato Berendsen (59) ukjamaraki, ukatxa proceso de producción uksanxa, presión ukaxa barostato Parrinello-Rahman (60) ukjamaraki. Taqi tuqinxa, presión promedio ukaxa 1 bar ukjamaraki esquema de acoplamiento de presión semiisotrópica ukjamaraki. Aka equilibrio ukhamaraki producción uksanxa, mä termostato (61) recalibración de velocidad ukampiwa lurataraki, ukhamata acoplamiento de temperatura de partículas proteicas, lípidas ukhamaraki disolventes ukjamaraki. Taqi lurawi taypinxa, meta temperatura ukaxa 310K ukhawa. Uka jan vinculación ukan mayacht’asiwipax mä lista de pariaje uñstayañampiw jakthapita, ukax esquema Verlet ukampiw lurasi, ukax 0,005 tolerancia de búfer ukampiw lurasi. Aka término Coulomb ukaxa jakhthapitawa campo de reacción ukampi ukhamaraki mä distancia de corte 1,1 nm. Vander Waals uka término ukaxa mä esquema de corte ukampiwa apnaqasi, ukaxa mä distancia de corte 1,1 nm ukjamawa, ukatxa esquema de corte Verlet ukaxa deriva potencial ukataki apnaqatarakiwa (62).
VMD apnaqasa, longitud de onda de corte entre perlas de fosfato DOPC jan ukaxa perlas de ceramida AM1 ukatxa proteína ukaxa 0,7 nm ukjawa, ukatxa jakhthapitawa lípidos ukanakaxa proteína ukampiwa chikañchasipxi. Aka fórmula ukarjamaxa, factor de depleción-enriquecimiento (DE) ukxa jakhthapitawa kunjamatixa (63) siski ukhama: factor DE = (cantidad de lípidos totales en la proteína 0,7) en la proteína 0,7 (cantidad de Cer en total lípidos) .
Yatiyat chimpunakax mä promedio ukham apsutawa, ukatx barras de error ukax pusi independientes copias SE ukankiwa. Uka significancia estadística ukaxa factor DE ukjamaraki t prueba [(promedioDE-factor-1)/SE] ukampiwa jakthapita. Mä chuyma jaljawitxa P chimpuxa jakhthapitawa.
Aka herramienta GROMACS ukaxa luratarakiwa mapa de densidad lateral 2D uka sistema ukanxa Emp24 ukampi qhipa 250 ns ukja rastro ukanxa. Mapa de enriquecimiento/depleción de ceramida uksa apsuñatakixa, mapa de densidad Cer uksa tuqita uñakipatarakiw suma mapa Cer y DOPC uksa tuqita, ukxaruxa jaljatarakiwa concentración de Cer uksa tuqita cuerpo uksana. Pachpa color mapa escala ukax apnaqatarakiwa.
Aka qillqatan materiales suplementarios ukanakatakix http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ukar mantasma
Akax mä qillqat jist’arat uñt’ayawiwa, ukax Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ukan kamachinakaparjamaw jaljasi, ukax kuna medios ukan apnaqañapataki, jaljañapataki ukhamarak uñstayañapatakiw jayti, kunapachatix qhipa apnaqañax jan comercial ganancia ukat premisa ukax nayrïr lurawix chiqaw sañ muni. Yaqha.
Qhanacht’awi: Correo electrónico ukar uñt’ayañakiw mayipxsma, ukhamat khititix página ukar iwxt’kta ukax yatiñapataki, jupanakax correo electrónico ukar uñjañ munapxta ukat janiw spam ukhamäkiti. Jiwasax janiw kuna correo electrónico ukanakas katjañäniti.
Aka jiskt’awix mä visitante ukhamätati janicha uk yant’añatakiw apnaqasi ukat automático spam ukar jan uñt’ayañatakiw apnaqasi.
Sofía Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gómez (Alejandro Cortes-Gómez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz jupanakax ukham uñt’atawa
3D jach’a resolución chiqapa pachana uñacht’ayiwa ceramida cadena largo ukaxa wali wakiskiriwa proteína uñakipañataki sitios de salida selectiva ukanakana.
Sofía Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gómez (Alejandro Cortes-Gómez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz jupanakax ukham uñt’atawa
3D jach’a resolución chiqapa pachana uñacht’ayiwa ceramida cadena largo ukaxa wali wakiskiriwa proteína uñakipañataki sitios de salida selectiva ukanakana.
©2020 Asociación Americana para el Adelanto de la Ciencia uka tuqita. taqi derechos ukanakaxa jark’atawa. AAAS ukax HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ukat COUNTER ukanakan yanapiripawa. CienciaAvances ukax ISSN 2375-2548 ukaruw uñt’ayasi.