Metabolitos inmunomoduladores ukaxa mä jach’a lurawiwa microambiente tumoral (TME) uksanxa, ukampisa mä qawqha excepciones ukanakampixa, identidad ukaxa jilpachxa janiwa yatiskiti. Aka tuqinxa, tumores ukatxa células T ukanakaxa tumores ukatxa ascitis ukanakatxa carcinoma seroso de alto grado (HGSC) ukankirinakata uñakipatawa, ukhamata metabólomo uka kunaymana compartimientos TME ukanaka uñacht’ayañataki. Ascitis ukat células tumorales ukanakax metabolitos ukanakax wali mayjt’atawa. Aka ascitis ukanakampi chikachasiñatakixa, células T tumor-infiltrantes ukanakaxa wali sumawa 1-metilnicotinamida (MNA) ukampiwa. Ukhamaraki, nivel de MNA ukaxa células T uksanxa wali jach’akiwa, ukampirusa, expresión de nicotinamida N-metiltransferasa (mä enzima cataliza la transferencia de grupos metilos de S-adenosilmetionina a nicotinamida) ukaxa fibroblastos ukatxa células tumorales ukanakarukiwa. Funcionalmente, MNA ukaxa células T ukanakaruxa ch’amancharakiw citoquina tumor-promotora factor de necrosis tumoral alfa ukar mistuñapataki. Ukhamarusa, TME-derivado MNA ukaxa yanapt’iwa regulación inmune de células T ukaru ukhamaraki uñacht’ayiwa mä potencial meta inmunoterapia jaqina cáncer usut qullañataki.
Metabolitos tumorales ukata apsutanakaxa mä jach’a inhibidor ukhamawa inmunidad antitumoral ukaru, ukatxa juk’ampi juk’ampi yatxatawinakaxa uñacht’ayiwa mä ch’ama ch’amañchiri ukhamaraki usunaka jilxatañataki (1). Ukhamaraki, efecto Warburg ukatxa, jichha lurawixa qalltawayiwa estado metabólico de células tumorales ukatxa estado inmunológico microambiente tumoral (TME) ukampi chikañchasiñataki. Yatxatawinakaxa modelos de ratas ukatxa células T jaqina uñacht’ayiwa metabolismo glutamina (2), metabolismo oxidativo (3) ukhamaraki metabolismo glucosa (4) ukaxa independientemente lurapxaspaw kunaymana subgrupos de células inmunes ukanakaru. Aka thakhinakanx walja metabolitos ukanakax células T ukan antitumoral función ukarux jark’aqi. Uñacht’ayatarakiwa aka bloqueo de la coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) ukaxa jan walt’ayaspawa proliferación de células T ukaru, ukatxa jilxataspawa BH4 ukaxa cuerponxa ch’amanchaspawa respuesta inmune antitumoral mediada por CD4 ukatxa CD8. Ukhamaraki, efecto inmunosupresivo de la kynurenina ukaxa qhispiyatarakiwa BH4 ukampi (5). Aka glioblastoma mutante deshidrogenasa isocitrato (IDH) uksanxa, secreción de enantiometabólico (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) ukaxa jark’akiwa activación de células T, proliferación ukhamaraki Actividad de citolisis (6). Jichha pachanxa, uñacht’ayatarakiwa metilglioxal, mä subproducto de glicólisis, ukaxa luratarakiwa células supresor de origen mieloide ukanakampi, ukatxa transferencia de células T de metilglioxal ukaxa jark’aqarakispawa función de células T efectoras. Qullañ tuqinxa, neutralización de metilglioxal ukaxa atipjaspawa actividad de células supresor derivadas de mieloides (MDSC) ukatxa sinérgicamente ch’amancharakispawa terapia de bloqueo de puntos de control ukaxa modelos de ratas ukanxa (7). Aka yatxatawinakax mayacht’asisaw metabolitos derivados de TME ukan lurawip jach’anchayapxi, ukax células T ukan lurawipa ukhamarak actividad ukanakap regulañataki.
Disfunción de células T ukax cáncer de ovario ukanx wali yatiyatawa (8). Ukax mä chiqanx características metabólicas inherentes hipoxia ukat vasculatura tumoral anormal (9) ukat uñstayatawa, ukax glucosa ukat triptófano ukanak subproductos ukar tukuyañatakiwa, kunjamatix ácido láctico ukat kynurenina. Aka lactato extracelular ukjamaraki interferón-γ (IFN-γ) uksa lurawixa jisk’achatarakiwa ukhamaraki subgrupos mielosupresores uksa tuqita diferenciación uksa tuqita (10, 11). Aka triptófano uksa manq’añaxa chiqapa jark’iwa proliferación de células T ukatxa jark’aqirakiwa señalización receptora de células T (12-14). Ukhama uñjawinakampixa, walja lurawinakawa metabolismo inmunológico uksa tuqiruxa lurataraki cultivo de células T in vitro ukanxa medios optimizados ukanakampi, jan ukaxa modelos homólogos de ratas in vivo ukanakampiwa limitata, janiwa maynis taqpacha uñacht’aykiti heterogeneidad de cánceres humanos ukhamaraki macro y micro fisiológico medio ambiente.
Cáncer de ovario ukan mä uñacht’äwipax peritoneal ukan jilxattatapa ukat ascitis ukan uñstatapawa. Aka acumulación de líquido celular ascitis uksanxa, ukaxa nayraru sartaña usumpi ukhamaraki jan wali pronóstico ukampi (15). Yatiyawinakarjamaxa, aka sapa mayni compartimiento ukaxa hipóxico ukhamawa, ukaxa wali jach’a niveles de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ukhamaraki indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) ukanakampiwa, ukatxa células reguladoras T ukhamaraki células inhibidoras mieloides ukanakampiwa infiltrada (15-18). Ascitis ukan metabólico ukan pachapax tumor ukan mayjt’awipat sipanx mayjäspawa, ukhamax células T ukan reprogramación ukanx espacio peritoneal ukanx janiw qhanakiti. Ukhamaraki, jach’a mayjt’awinaka ukhamaraki heterogeneidad ukanakaxa ascitis ukatxa metabolitos ukanakaxa tumor ukana utjki ukanakaxa jark’aspawa células inmunes ukanakana infiltración ukhamaraki función ukanakaxa tumores ukanakaru, ukatxa juk’ampi yatxatañawa wakisi.
Aka jan walt’awinaka askichañatakixa, mä separación celular sensitiva ukhamaraki cromatografía líquida espectrometría de masas tándem (LC-MS/MS) ukanakampiwa lurataraki kunaymana kasta celulas ukanakata yatxatañataki (ukaxa células T CD4 + ukhamaraki CD8 + T ukanakampi) ukhamaraki tumores ukanaka taypina ukhamaraki tumores ukanaka taypina Its metabolites span células en el mismo ascitis y entorno tumoral del paciente. Aka lurawixa citometría de flujo alta dimensional ukhamaraki secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) ukanakampi chikt’ata apnaqatarakiwa, ukhamata mä jach’a resolución retrato uñacht’ayañataki estado metabólico uka poblaciones claves ukanakampi. Aka lurawixa uñacht’ayiwa mä jach’a jilxatawi nivel de 1-metilnicotinamida (MNA) ukanxa células T tumorales ukanxa, ukatxa experimentos in vitro ukanxa uñacht’ayatawa efecto inmunomodulador de MNA ukaxa función de células T ukaruxa nayraqata janiwa yatiskiti. Jilapachaxa, aka lurawixa uñacht’ayiwa maynit maynikama metabólicos ukanaka tumores ukatxa células inmunes ukanaka taypina, ukatxa churarakiw mä sapa amuyunaka metabolitos de regulación inmunológica ukanakata, ukaxa wali askïspawa qullañataki inmunoterapia de cáncer de ovario basado en células T Tratamiento oportunidades.
Jiwasaxa citometría de flujo alta dimensional ukampi luratarakiwa mä pachana glucosa uksa tuqita [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) ukhamaraki actividad mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ukanakaxa lado lado típico ukhamawa marcadores ukaxa células inmunes ukatxa poblaciones de células tumorales ukanaka yaqhachapxi (Tabla S2 ukatxa Figura S1A). Aka uñakipawixa uñacht’ayiwa células T ukanakampi chikachasiñatakixa, ascitis ukatxa células tumorales ukanakaxa juk’ampi niveles de absorción de glucosa ukaniwa, ukampisa actividad mitocondrial ukanxa juk’ampi jisk’a mayjt’awinakaniwa. Aka promedio glucosa apsutaxa células tumorales [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ukjamaraki kimsa pusi ukjawa células T ukjamaraki, ukatxa promedio glucosa apsutaxa células T CD4 + T ukjamaraki 1,2 ukjawa aka células T CD8 + TIL ukjamaraki, ukaxa uñacht’ayiwa linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) ukanakaxa mayja mayja requisitos metabólicos ukanipxiwa pachpa TME uksanxa (Figure 1A). Uka kipkaraki, actividad mitocondrial ukaxa células tumorales uksanxa células T CD4 + T ukanakampi kikiparakiwa, ukatxa actividad mitocondrial ukaxa pä kasta celulanakanxa jilpachawa células T CD8 + T uksatxa (Figure 1B). Jilapachaxa, aka yatxatawixa nivel metabólico uñacht’ayi. Aka actividad metabólica ukaxa células tumorales ukatxa jilpachawa aka células T CD4 + ukatxa, ukatxa actividad metabólica ukaxa células T CD4 + ukatxa jilpachawa. Ukhampachasa aka efectos ukanakaxa tipos celulares ukanakanxa, janiwa mä constante mayjt’awixa utjkiti estado metabólico de células T CD4 + ukhamaraki CD8 + ukanakana jani ukaxa proporciones relativas ukanakaxa ascitis ukanxa tumores ukanakampi chikachasiñataki (Figure 1C). Uka kipkaraki, fracción CD45-células uksanxa, proporción de células EpCAM+ ukaxa tumor uksanxa jilxatarakiwa ascitis ukanakampi chikachasiñataki (Figure 1D). Ukhamaraki, uñjasiraki mä qhana metabólico mayjt’awi EpCAM+ ukhamaraki EpCAM- componentes celulares ukanakampi. Aka EpCAM+ (tumor) celulanakaxa juk’ampi glucosa apsuña ukhamaraki actividad mitocondrial ukanakampi EpCAM- celulas ukanakatxa, ukaxa juk’ampi jach’a actividad metabólica fibroblastos ukanakatxa células tumorales TME uksana (Figure 1, E y F).
(A y B) Intensidad mediana de fluorescencia (MFI) de la absorción de glucosa (2-NBDG) (A) ukhamaraki actividad mitocondrial de células T CD4 + (MitoTracker ch’iyara wila) (B) Gráficos representativos (ch’iqa) ukhamaraki datos tabulados (Derecha), células T CD8 + ukhamaraki células EpCAM + CD45-tumoral de ascitis ukatxa tumor. (C) Aka ratio de células CD4 + ukhamaraki CD8 + (de células T CD3 +) ukanakaxa ascitis ukatxa tumor ukanakanxa. (D) Proporción de células tumorales EpCAM + ukanakaxa ascitis ukatxa tumor (CD45−) ukanakana. (E y F) EpCAM + CD45-tumor ukatxa EpCAM-CD45-matriz glucosa apsuña (2-NBDG) (E) ukhamaraki actividad mitocondrial (MitoTracker ch’iyara wila) (F) gráficos representativos (ch’iqa) ukhamaraki datos tabulados ( Kupi) Ascitis ukatxa células tumorales. (G) Gráficos representativos de expresión CD25, CD137 ukatxa PD1 ukaxa citometría de flujo tuqiwa lurataraki. (H y I) CD25, CD137 ukatxa PD1 expresión ukaxa células T CD4 + (H) ukhamaraki células T CD8 + (I) ukanakanwa. (J y K) Fenotipos ingenuos, memoria central (Tcm), efector (Teff) ukhamaraki memoria efector (Tem) ukanakaxa CCR7 ukhamaraki CD45RO ukanakana expresión ukanakampiwa lurataraki. Imagenes representativas (izquierda) ukhamaraki datos tabulares (derecha) de células T CD4 + (J) ukhamaraki células T CD8 + (K) ascitis ukatxa tumores ukanakana. P ukjamaraki t-test pareado ukjamaraki (*P<0,05, **P<0,01 ukhamaraki ***P<0,001). Uka chimpuxa uñakipata usutanakaru (n = 6). FMO, fluorescencia ukatxa mä; MFI, ukaxa mediana de intensidad de fluorescencia ukawa.
Juk’ampi uñakipañaxa yaqha jach’a mayjt’awinaka uñacht’ayiwa estado fenótico de células T wali resolución ukanxa. Aka activada (Figure 1, G a I) ukhamaraki efector memoria (Figure 1, J y K) tumores uksanxa juk’ampi uñakipatawa ascitis (proporción de células T CD3 + T) ukanakatxa. Ukhamaraki, análisis de fenotipo ukaxa expresión de marcadores de activación (CD25 y CD137) ukhamaraki marcadores de depleción [proteína de muerte celular programada 1 (PD1)] uñacht’ayiwa, ukampirusa aka poblaciones ukanakana características metabólicas ukanakaxa mayjawa (Figure S1, B a E) , Ukampisa janiwa mä diferencias metabólicas significativas ukanakaxa constantemente uñjasiwaykiti subconjuntos ingenuos, efector jan ukaxa memoria ukanaka taypina (Figure S1, F a I). Aka lurawixa chiqapawa maquina de aprendizaje ukampi automáticamente fenotipos celulares (21) ukanaka churañataki, ukaxa juk’ampi uñacht’ayiwa walja células médula ósea (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ukanaka utjatapa usuta ascitis ukanxa (Figure S2A ). Taqi kasta celula uñt’atanakatxa, aka población de células mieloides ukaxa uñacht’ayiwa jilpacha glucosa apsuña ukhamaraki actividad mitocondrial (Figure S2, B a G). Aka yatxatawixa uñacht’ayiwa ch’amani metabólico mayjt’awinaka walja kasta células ukanakana jikxatasiwa ascitis ukhamaraki tumores ukanakana HGSC usutanakaru.
TIL ukan características metabonómicas ukanaka amuyañatakix jach’a jan walt’awix tumores ukanakat muestras de células T ukanakax suficiente q’uma, calidad ukat cantidad ukanakan apsutäñapawa. Jichha yatxatawinakaxa uñacht’ayiwa aka clasificación ukhamaraki enriquecimiento de perlas ukaxa citometría de flujo ukampi luratarakiwa, ukaxa mayjt’ayaspawa perfiles de metabolitos celulares ukanakaru (22-24). Aka jan walt’awiru atipjañatakixa, optimizamos el método de enriquecimiento de perlas ukaxa TIL uksa tuqita apsuñataki ukhamaraki uksa tuqita apsuñataki cáncer de ovario humano resecado quirúrgicamente ukatxa janïra análisis LC-MS/MS tuqi (uñxatma Materiales y Métodos; Figura 2A). Aka protocolo ukaxa taqpacha impacto metabolito mayjt’awinakaru uñakipañatakixa, perfiles metabolitos de células T activadas por donantes saludables ukatxa aka pata paso de separación de perlas ukatxa células ukanakampi chikachasiñawa, ukaxa janiwa perlas ukjamaraki hielo uksana qhiparapxi. Aka análisis de control de calidad ukaxa jikxatasiwa mä jach’a correlación aka pä condiciones ukanaka taypina (r = 0,77), ukatxa repetibilidad técnica ukaxa 86 metabolitos qututxa wali repetibilidad ukaniwa (Figure 2B). Ukhamarusa, aka lurawinakaxa lurasirakispawa chiqapa análisis de metabolitos celulas ukanakana enriquecimiento tipo celular ukanxa, ukhamata nayrïri plataforma de alta resolución uñacht’ayañataki metabolitos específicos ukanaka HGSC ukanxa, ukhamata jaqinakaxa juk’ampi manqhana amuyt’apxañapataki especificidad celular Programa de metabolismo sexual.
(A) Diagrama esquemático de enriquecimiento de perlas magnéticas uka tuqita. Janïra LC-MS/MS tuqi uñakipañatakixa, celulanakaxa kimsa muyuntata consecutivas de enriquecimiento de perlas magnéticas ukanakampiwa luratarakini jan ukaxa hielo ukanwa qhiparapxani. (B) Tipo de enriquecimiento ukaxa metabolitos ukanakana walja utjatapata. Ukasti kimsa tupuwi sapa kasta enriquecimiento ± SE. Gris chimpux 1:1 ukham uñt’atawa. Correlación intra-clase (ICC) ukaxa walja kuti tupunakaxa uñacht’ayatawa etiqueta eje ukanxa. NAD, nicotinamida adenina dinucleótido ukampi. (C) Diagrama esquemático de flujo de trabajo de análisis de metabolitos pacientes uka tuqita. Ascitis jan ukax tumores ukanakax usutanakat apthapitawa ukatx criopreservado ukhamawa. Sapa muestra uksatxa mä jisk’a chiqawa citometría de flujo ukampiwa uñakipata, ukatxa qhipa muestras ukanakaxa kimsa muyuntata enriquecimiento ukampiwa lurataraki células CD4+, CD8+ ukhamaraki CD45- ukanakataki. Aka fracciones celulares ukanakaxa LC-MS/MS ukampiwa uñakipata. (D) Mapa de calor de abundancia de metabolitos estandarizados ukanaka. Dendrograma ukaxa Ward jupan agrupación de distancias euclídeas ukanaka muestras ukanaka taypina uñacht’ayi. (E) Análisis de componentes principales (PCA) de mapa de metabolitos de muestra, uñacht’ayiwa kimsa replicados sapa muestra, muestras de la misma usuta ukaxa mä línea ukampiwa mayachataraki. (F) PCA ukaxa perfil metabolito ukatxa muestra condicionada uka usuta jaqiru (mä arunxa, redundancia parcial apnaqasa); uka muestra tipo ukaxa casco convexo ukampi chika luratawa. PC1, jach’a componente 1; PC2, jach’a componente 2.
Ukxarusti, aka enriquecimiento lurawixa apnaqatarakiwa 99 metabolitos ukanaka uñakipañataki aka fracciones de células CD4 +, CD8 + ukhamaraki CD45 ukanakana ascitis primaria ukhamaraki tumores ukanakana suxta HGSC usutanakaru (Figure 2C, Figura S3A y Tabla S3 y S4). Población de interés ukaxa 2% ukatxa 70% ukjawa jach’a muestra original de células vivas ukatxa, ukatxa proporción de células ukaxa usutanaka taypinxa wali mayjt’atawa. Perlas uksa jaljata ukxaruxa, fracción enriquecida de interés (CD4+, CD8+ jan ukaxa CD45-) ukjamaraki 85% ukjawa taqpacha células vivas ukanakatxa muestra uksanxa promedio ukjamaraki. Aka enriquecimiento lurawixa jaqina tumor tejido metabolismo ukata poblaciones celulares ukanaka uñakipañatakixa, ukaxa janiwa jach’a muestras ukanakatxa lurañjamakiti. Aka protocolo apnaqasa, yatxatapxaraktwa l-kinurenina ukatxa adenosina, aka pä metabolitos inmunosupresores suma uñt’ata ukanakaxa jilxatayatarakiwa células T tumorales jan ukaxa células tumorales ukanakana (Figure S3, B y C). Ukhamarusa, aka lurawixa uñacht’ayiwa fidelidad ukhamaraki capacidad jiwasana separación celular ukhamaraki tecnología de espectrometría de masas ukanakampi metabolitos biológicamente importantes ukanaka jikxatañataki usut tejidos ukanakana.
Jiwasana uñakipañasaxa uñacht’ayarakiw mä ch’aman separación metabólica de tipos celulares ukanaka usutanaka taypina ukhamaraki usutanaka taypina (Figure 2D y Figura S4A). Jisk’a tuqitxa, yaqha usutanakampi chikachasiñatakixa, 70 usuta jaqixa kunaymana metabólicos uñacht’ayi (Figure 2E y Figura S4B), ukaxa uñacht’ayiwa inasa heterogeneidad metabólica jach’a usutanaka taypina utjchispa. Ukhamaraki, yaqha usutanakampi chikachasiñatakixa (1,2 a 2 litros; Tabla S1), taqpacha ascitis apthapita 70 usutanakaru (80 ml) juk’ampi jisk’akiwa. Aka control de heterogeneidad inter-paciente ukaxa análisis de componentes principales ukjakama (santi, análisis de redundancia parcial ukampi) uñacht’ayiwa mayjt’awinaka constante ukhama celulas tipos ukanaka taypina, ukatxa tipos celulares ukatxa/jan ukaxa microambiente ukaxa qhana agregados ukhamawa perfil metabolito ukarjama (Figure 2F). Uka análisis de metabolitos únicos ukaxa wali ch’amanchatawa aka efectos ukatxa uñacht’ayatarakiwa wali mayjt’awinaka celulas tipos ukatxa microambiente ukanakampi. Ukhamaraki, juk’ampi jach’a mayjt’awixa uñjasiwa MNA, ukaxa jilpachaxa qamiriptayatawa células CD45- ukhamaraki células CD4+ ukhamaraki CD8+ ukanakana tumor ukarux mantaraki (Figure 3A). CD4 + celulanakatakixa, aka efectox juk’amp qhanaw uñjasi, ukatx MNA ukax CD8 + celulanakanx medio ambiente ukanx wali ch’amampiw jan walt’ayat uñjasiraki. Ukampirus ukax janiw wakiskirïkiti, kunatix suxta usutanakatxa kimsa usutanakakiw tumor CD8+ ukan puntuacionanakapat uñakipataspa. Ukhamaraki, MNA ukjamaraki, kunaymana kasta celulas ascitis ukhamaraki tumores ukanakana, yaqha metabolitos ukanakaxa janiwa suma uñt’atäkiti TIL uksanxa, ukhamaraki diferencialmente rico (Figures S3 y S4). Ukatwa, aka yatxatawinakax mä prometedor conjunto de metabolitos inmunomoduladores uñacht’ayi juk’amp yatxatañataki.
(A) Contenido normalizado de MNA ukanakaxa células CD4+, CD8+ ukhamaraki CD45- ukanakana ascitis ukatxa tumor ukanakatxa. Uka cuadro ukanxa uñacht ayatawa mediana (línea), intercuartílico (bisagra de marco) ukhamaraki datos ukanaka, 1,5 ukja intercuartílico (bargo de marco) ukjakama. Kunjamatixa Materiales y Métodos de Pacientes ukanxa qhananchata, ukaxa usuta jaqina limma ukampiwa P valor uñakipañatakixa (*P<0,05 ukhamaraki **P<0,01). (B) Diagrama esquemático ukaxa metabolismo MNA ukatxa (60). Metabolitos: S-adenosil-1-metionina ukaxa mä juk’a pachanakwa lurasi; SAH, S-adenosina-1-homocisteína ukampi; NA, nicotinamida ukat juk’ampinaka; MNA, 1-metilnicotinamida ukampi; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-carboxamida ukjamaraki; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida ukjamaraki; NR, nicotinamida ribosa ukaxa; NMN, ukaxa nicotinamida mononucleótido satawa. Enzimas (ch’uxña): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuins, ukat juk’ampinaka; NAMPT, nicotinamida fosforibosil transferasa ukampi; AOX1, aldehído oxidasa 1 ukampi; NRK, nicotinamida ribosido quinasa ukaxa; NMNAT, nicotinamida mono Nucleótido adenilato transferasa ukampi; Pnp1, purina nucleósido fosforilasa ukampi. (C) t-SNE de scRNA-seq de ascitis (gris) ukhamaraki tumor (wila; n = 3 usutanaka). (D) Expresión NNMT kunaymana poblaciones celulares ukanakana uñt’atarakiwa scRNA-seq. (E) Expresión de NNMT y AOX1 en SK-OV-3, riñón embrionario humano (HEK) 293T, células T ukatxa células T tratadas con MNA. Uka expresión doblada ukaxa uñacht’ayatawa SK-OV-3 ukarjama. Uka patrón de expresión ukaxa SEM ukampixa uñacht’ayatawa (n = 6 donantes saludables). Ct 35 ukjat jila valores ukanakax jan uñjkaya (UD) ukham uñjatawa. (F) Expresión de SLC22A1 y SLC22A2 en SK-OV-3, HEK293T, células T ukatxa células T tratadas con 8mM MNA. Uka expresión doblada ukaxa uñacht’ayatawa SK-OV-3 ukarjama. Uka patrón de expresión ukaxa SEM ukampixa uñacht’ayatawa (n = 6 donantes saludables). Ct 35 ukjat jila valores ukanakax jan uñjkaya (UD) ukham uñjatawa. (G) Contenido de MNA celular ukanakaxa células T donantes k’umara activadas ukanakana 72 horas ukja incubación MNA ukampiwa lurataraki. Uka patrón de expresión ukaxa SEM ukampixa uñacht’ayatawa (n = 4 donantes saludables).
MNA ukjamaraki metilo ukjamaraki S-adenosil-1-metionina (SAM) ukjamaraki nicotinamida (NA) ukjamaraki nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT; Figura 3B) ukjamaraki. NNMT ukaxa sinti expresada ukhamawa kunaymana jaqinakaru cánceres ukanakana ukhamaraki proliferación, invasión ukhamaraki metástasis ukanakampi (25-27). Aka MNA uksa tuqita juk’ampi amuyañatakixa, TME uksanxa, scRNA-seq ukampiwa lurataraki, ukhamata caracterización de la expresión de NNMT a través de tipos de células en el ascitis y tumores de tres pacientes de HGSC (Tabla S5). Análisis de niya 6.500 células uñacht’ayiwa ascitis ukhamaraki tumor ukanakana, expresión NNMT ukaxa restringida ukhamawa presunta poblaciones de fibroblastos ukhamaraki células tumorales ukanakaru (Figure 3, C y D). Ukhamaraki, janiwa qhana expresión NNMT ukaxa utjkiti kuna población ukanxa PTPRC (CD45 +) uñacht’ayi (Figure 3D y Figura S5A), ukaxa uñacht’ayiwa MNA uñakipata espectro metabolito uksanxa células T uksaru mantata. Aka expresión de aldehído oxidasa 1 (AOX1) ukjamaraki MNA ukjamaraki 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) jan ukaxa 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4- PYR) ukjamaraki; Figura 3B) ukaxa restringida ukhamaraki población de fibroblastos expresadores COL1A1 (Figure S5A), ukaxa taqpachaniwa uñacht’ayi células T ukaxa janiwa capacidad metabolismo convencional MNA ukampi utjkiti. Aka patrón de expresión ukaxa aka MNA ukampi chikañchata genes ukampixa chiqapawa mä segunda conjunto de datos celulares independientes ukampi ascitis ukanakatxa HGSC usutanakatxa (Figure S5B; n = 6) (16). Ukhamaraki, análisis cuantitativo de reacción en cadena de polimerasa (qPCR) de células T donantes saludables tratadas con MNA uñacht’ayiwa, células tumorales ovarias control SK-OV-3 ukanakampi chikachasiñatakixa, NNMT jan ukaxa AOX1 ukaxa niya jani uñacht’ayatakiti (Figure 3E). Aka jan suyt’at yatxatawinakax uñacht’ayiwa MNA ukax fibroblastos jan ukax tumores ukanakat células T jak’ankir TME ukar mistuñapawa.
Ukhamaraki, candidatos ukaxa familia de transportadores catiónicos orgánicos 1 a 3 (OCT1, OCT2 y OCT3) codificados por la familia portadora soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 y SLC22A3), ukampirusa, transportadores potenciales de MNA ukaxa wali qhananchatawa (28) . QPCR de ARNm de células T donantes saludables uñacht’ayiwa jisk’a niveles de expresión de SLC22A1 ukampisa niveles indetectables de SLC22A2, ukaxa chiqapawa nayraqata yatiyata qillqatanakanxa (Figure 3F) (29). Uka kipkaraki, línea celular tumor ovaria SK-OV-3 ukaxa uñacht’ayiwa jach’a niveles de ambos transportadores (Figure 3F).
Uka yant’añatakixa células T ukanakaxa MNA extranjera uksa ch’amthapiñapatakixa, k’umara células T donantes ukanakaxa 72 horas ukjamawa yapuchataraki kunaymana concentraciones de MNA ukanakampi. Aka MNA exógena uksa tuqita, contenido celular MNA uksa tuqita janiwa yatxatañjamakiti (Figure 3G). Ukampirusa, células T activadas tratadas con MNA exógena ukaxa uñacht’ayiwa mä dosis dependiente ukhama jilxatawi contenido de MNA celulas uksana, 6 mM MNA ukjakama (Figure 3G). Aka lurawixa uñacht’ayiwa jisk’a nivel de expresión transportadora ukhamaraki jani utjatapa enzima principal responsable metabolismo intracelular MNA ukatxa, TIL ukaxa wali MNA uksa apthapispawa.
Aka espectro de metabolitos ukaxa usutanakan células T ukatxa experimentos de absorción de MNA in vitro ukaxa jilxatiwa fibroblastos asociados a cáncer (CAF) ukaxa MNA uksa tuqita mistuyañataki ukhamaraki células tumorales ukaxa regular la fenotipo ukhamaraki función de TIL. Aka MNA ukaxa células T ukanakaru kunjamasa ukxa yatiñatakixa, k’umara células T donantes ukanakaxa activadas in vitro ukanxa MNA ukanxa jan ukaxa jani utjkipana, ukatxa proliferación ukhamaraki citoquinas ukanaka lurawixa uñakipatarakiw. 7 urunaka MNA ukjamaraki jilpacha dosis ukjamaraki, población doble jakhüwixa mä juk’a jisk’achatarakiwa, ukatxa vigor ukaxa taqi dosis ukjamaraki (Figure 4A). Ukhamaraki, tratamiento de MNA exógena ukaxa mä jilxatawi proporción de células T CD4 + ukhamaraki CD8 + expresadoras de factor de necrosis tumoral-α (TNFα; Figura 4B). Uka kipkaraki, IFN-γ uksa intracelular uksa lurawixa wali jisk’achatarakiwa células CD4 + T uksanxa, ukampisa janiwa células T CD8 + uksanxa utjkiti, ukatxa janiwa mä jach’a mayjt’awixa utjkiti interleucina 2 uksanxa (IL-2; Figura 4, C y D). Ukhamarusa, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) ukaxa sobrenadantes ukatxa aka cultivos de células T tratadas con MNA ukatxa uñacht’ayiwa mä jach’a jilxatawi TNFα, mä jisk’achawi IFN-γ, ukhamaraki janiwa mayjt’awi IL-2 (Figure 4, E a G). . Aka IFN-γ uksa jisk’achawixa uñacht’ayiwa MNA ukaxa mä rol uñacht’ayaspawa actividad antitumoral de células T uksa jark’aqañataki. Aka MNA uksa tuqita citotoxicidad mediada por células T uksa tuqita simulación lurañatakixa, células quiméricas receptora de antígeno T (FRα-CAR-T) ukanakaxa receptor de folato α ukatxa CAR-T (GFP) uksa tuqiru uñtatawa, ukaxa reguladas por proteína fluorescente verde (GFP) -CAR-T) ukanakampiwa lurataraki, ukaxa células mononucleares de sangre periféricas de donantes saludables (PBMC) ukanakampiwa lurataraki. Aka células CAR-T ukjamaraki 24 horas ukjamaraki MNA ukjamaraki co-cultivo ukjamaraki células tumorales ovarias humanas SK-OV-3 ukanakampi expresada receptor de folato α ukjamaraki mä relación efector a meta 10:1. MNA ukjamaraki tratamiento ukaxa wali jisk’achatarakiwa jiwayañataki aka FRα-CAR-T celulas ukjamaraki, ukaxa niya kipkarakiwa FRα-CAR-T ukjamaraki adenosina ukjamaraki (Figure 4H).
(A) Conteo total de células viables ukatxa doblezamiento poblacional (PD) directamente cultivo uksatxa 7. Aka gráfico de barras ukaxa promedio + SEM suxta k’umara donantes ukanaka uñacht’ayi. Uñacht’ayiwa yatxatawi n = 3 independientes experimentos ukanakata. (B a D) CD3/CD28 ukatxa IL-2 ukaxa apnaqatarakiwa activación células T ukanakaru concentraciones respectivas de MNA ukanakampi 7 urunaka. Janïra análisis lurañatakixa, celulanakaxa PMA/ionomicina ukampiwa GolgiStop ukampiwa 4 horas ukjama ch’amanchataraki. TNFα (B) expresión ukaxa células T uksankiwa. Uñacht’awi uñacht’awi (ch’iqa) ukhamaraki datos tabulares (chiqa) TNFα expresión ukanaka jakawi celulas ukanakana. IFN-γ (C) ukatxa IL-2 (D) ukanakaxa células T ukanakanwa uñacht’ayasi. Aka expresión de citoquinas ukaxa citometría de flujo ukampiwa uñakipata. Gráfico de barras ukaxa promedio (n = 6 donantes saludables) + SEM uñacht’ayi. Ukaxa mä thakhi uñakipañataki variancia ukhamaraki medidas repetidas (*P<0,05 y **P<0,01) ukanakampiwa lurataraki, ukhamata P valor uñakipañataki. Uñacht’ayiwa yatxatawi n = 3 independientes experimentos ukanakata. (E a G) CD3/CD28 ukatxa IL-2 ukaxa apnaqatarakiwa activación de células T ukanakampi aka concentraciones de MNA ukanakampi 7 urunaka. Aka medio ukaxa apthapitawa nayraqata ukhamaraki qhipa 4 horas de estimulación PMA/ionomicina ukjamaraki. Aka concentraciones de TNFα (E), IFN-γ (F) ukhamaraki IL-2 (G) ukanakaxa ELISA tuqiwa uñakipata. Gráfico de barras ukaxa promedio (n = 5 donantes saludables) + SEM uñacht’ayi. P valor ukaxa mä thakhi análisis de variancia ukampi luratarakiwa ukhamaraki repetidas medidas (*P<0,05). Punto chimpuxa uñacht’ayiwa límite de detección uka uñakipañataki. (H) Ukaxa ensayo de lisis celular satawa. Aka FRα-CAR-T jan ukaxa GFP-CAR-T celulanakaxa adenosina (250μM) jan ukaxa MNA (10 mM) ukanakampiwa 24 horas ukjamaru chiqanchataraki, jan ukaxa janïra qullatäkipana (Ctrl). Aka sapa patakata jiwayata SK-OV-3 celulanakaxa uñakipatawa. P valor ukaxa Welch t yant’awimpiwa uñakipata (*P<0,5 ukhamaraki **P<0,01).
Ukhamarusa, mä mecánico amuyt’awi regulación de expresión TNFα dependiente de MNA ukatxa, mayjt’awinakaxa ARNm TNFα ukatxa células T tratadas MNA ukatxa uñakipatawa (Figure 5A). K’umara células T donantes tratadas con MNA ukaxa uñacht’ayiwa pä kuti jilxatawi niveles de transcripción TNFα, ukaxa uñacht’ayiwa MNA ukaxa dependiente ukhamawa regulación transcripcional TNFα ukatxa. Aka mecanismo regulatorio ukhama yatxatañatakixa, pä uñt’ata factores de transcripción ukaxa TNFα uksa tuqita regula, ukaxa factor nuclear de células T activadas (NFAT) ukhamaraki proteína específica 1 (Sp1), uñakipatarakiw MNA uksa tuqita MNA uksa tuqita promotor proximal TNFα uksa tuqiru ( 30 ). Aka promotor TNFα ukaxa 6 identificados sitios de unión NFAT ukatxa 2 sitios de unión Sp1, ukanakaxa mä chiqanwa uñakipata [-55 pares de bases (bp) de la 5’cap] (30). Inmunoprecipitación cromatina (ChIP) uñacht’ayiwa MNA ukampiwa qullasi, Sp1 uksa promotor TNFα uksaru ligado ukaxa kimsa kutiwa jilxati. Ukhamaraki NFAT ukar mantañax jilxattawayiwa ukatx jak’achasiwayiw wali wakiskir (Figure 5B). Aka yatxatawixa uñacht’ayiwa MNA ukaxa regula la expresión de TNFα ukhamaraki transcripción Sp1 tuqi, ukatxa mä juk’a pachana expresión de NFAT.
(A) Aka células T cultivadas janïra MNA ukampi chikachasiñatakixa, pliegue cambio de la expresión TNFα en células T tratadas con MNA. Uka patrón de expresión ukaxa SEM ukampixa uñacht’ayatawa (n = 5 donantes saludables). Uñacht’ayiwa yatxatawi n = 3 independientes experimentos ukanakata. (B) Aka promotor TNFα de células T tratadas con o sin 8 mM MNA ukjamaraki NFAT ukjamaraki Sp1 ukjamaraki (Ctrl) ukhamaraki PMA/ionomicina estimulación 4 horas ukjamaraki. Inmunoglobulina G (IgG) ukatxa H3 ukaxa control negativo ukhamaraki positivo ukjamaraki inmunoprecipitación ukjamaraki, ukjamaraki. Aka cuantificación de ChIP ukaxa uñacht’ayiwa Sp1 ukatxa NFAT ukaxa promotor TNFα ukampi chikt’ata aka células tratadas MNA uksanxa walja kutiwa jilxattawayi control ukampi chikachasiñataki. Uñacht’ayiwa yatxatawi n = 3 independientes experimentos ukanakata. P valor ukaxa walja t-test ukanakampiwa uñakipata (*** P <0,01). (C) HGSC ukjamaraki ascitas ukanakampi chikachasiñatakixa, células T (janiwa citotóxicas) ukanakaxa uñacht’ayapxiwa jilxatata expresión de TNF tumor ukanxa. Saminakapax kunayman usutanakaruw uñacht’ayi. Uñacht’ayata celulanakaxa aleatoriamente 300 ukjaruwa muestreada ukhamaraki jittered ukhamata limitar sobredibujo (** Padj = 0,0076). (D) Modelo propuesto de MNA ukaxa cáncer de ovario ukataki. MNA ukaxa células tumorales ukanakanwa lurataraki ukatxa fibroblastos ukanakaxa TME uksanxa luratarakiwa ukatxa células T ukanakampiwa apthapita. MNA ukaxa Sp1 uksa promotor TNFα uksaru ligado uksa jilxatayaraki, ukaxa transcripción TNFα uksa tuqiru ukhamaraki citoquinas TNFα uksa tuqiru puriyaraki. MNA ukaxa IFN-γ uksa tuqita jisk’acharaki. Inhibición de la función de células T ukaxa mä jisk’achawi jiwayaña ch’amampi ukhamaraki tumor jank’aki jiltawimpi.
Yatiyawinakarjamaxa, TNFα ukaxa nayraqataru ukhamaraki qhiparu antitumoral ukhamaraki antitumoral ukanakampiwa, ukampisa wali uñt’ata lurawimpiwa ch’amancharaki jiltawi ukhamaraki metástasis cáncer de ovario (31-33). Yatiyawinakarjamaxa, concentración de TNFα ukaxa ascitis ukatxa tejidos tumorales ukatxa cáncer de ovario ukampi usuntatanakanxa jilpachawa tejidos benignos ukatxa (34-36). Mecanismo tuqitxa, TNFα ukaxa regula la activación, función ukhamaraki proliferación de glóbulos blancos, ukhamaraki mayjt’ayaspawa fenotipo de células cancerosas (37, 38). Aka yatxatawimpi chika, análisis de expresión génica diferencial uñacht’ayiwa TNF ukaxa wali jach’a regulada ukhamawa células T ukanxa tejidos tumorales ukanxa ascitis ukanakampi chikachasiñataki (Figure 5C). Aka expresión TNF uksa tuqita jilxatawixa uñacht’ayatarakiwa poblaciones de células T uksanakanxa mä fenotipo no citotóxico (Figure S5A). Mä juk’a arumpixa, aka yatxatawinakax MNA ukax doble inmunosupresor ukhamarak tumor promotor ukham HGSC ukanx utjiw sasin amuyt’awiruw yanapt’i.
Etiquetado fluorescente ukaxa citometría de flujo ukampiwa lurataraki, ukaxa metabolismo TIL uksa tuqita yatxatañatakixa nayraqata lurawiwa. Aka yatxatawinakax uñacht’ayiwa, linfocitos periféricos de sangre jan ukax células T órganos linfoides secundarios ukanakampi chikachasiñatakixa, TIL murino ukhamaraki jaqina juk’ampi tendencia ukaniwa glucosa uksa apsuñataki (4, 39) ukhamaraki juk’ata juk’ata función mitocondrial uksa chhaqhayañataki (19, 40). Ukhampachasa aka yatxatawinxa uñjapxaraktwa, ukampirusa, jach’a lurawixa metabolismo de células tumorales ukatxa TIL ukampi chikachasiñawa pachpa tejido tumoral resecado ukatxa. Yaqhipa nayra yatiyawinakampi chika, células tumorales (CD45-EpCAM +) ukanakaxa ascitis ukatxa tumores ukanakatxa juk’ampi glucosa apsutarakiwa células T CD8 + ukhamaraki CD4 + ukanakatxa, ukaxa yanapt’iwa aka jach’a glucosa apsuñataki células tumorales ukanakaxa células T ukanakampi chikachasiñawa. Uka amuyunakax células T ukan atipt’asiwipawa. TME ukax mä juk’a pachanakanwa. Ukampirusa, actividad mitocondrial ukaxa células tumorales ukatxa juk’ampi jach’awa células T CD8 + ukatxa, ukampisa actividad mitocondrial ukaxa células T CD4 + ukampi kikiparakiwa. Aka yatxatawixa ch’amancharaki uka uñstaski uka tema ukaxa metabolismo oxidativo ukaxa wali wakiskiriwa células tumorales ukataki (41, 42). Ukhamaraki, jupanakaxa sapxiwa aka células CD8 + T ukaxa juk’ampi sumawa disfunción oxidativa ukaru purirakispa aka células CD4 + T ukatxa, jan ukaxa células T CD4 + ukaxa apnaqarakispawa fuentes de carbono ukatxa glucosa ukatxa actividad mitocondrial ukaru mantañataki (43, 44). Uñakipt’atarakiwa, janiwa mayjt’awixa uñjatäkiti glucosa uksa tuqita jani ukaxa actividad mitocondrial uksa tuqita efectores CD4 + T, memoria efector T ukatxa células de memoria central T uksa tuqita ascitis uksanxa. Ukhamaraki, estado de diferenciación de células T CD8 + tumores uksanxa janiwa kunasa mayjt’ayatakiti glucosa uksa tuqita, ukaxa uñacht’ayiwa wali mayjt’awi células T cultivadas in vitro ukhamaraki jaqina TIL in vivo (22). Aka uñjawinakaxa chiqapachatarakiwa asignación automática de población celular sin sesgo ukampi, ukaxa juk’ampi uñacht’ayiwa células CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ukaxa juk’ampi glucosa apsuña ukhamaraki actividad mitocondrial ukampi células tumorales ukanakatxa wali uñt’atawa ukampisa población celular activa Metabólica ukampi. Aka población ukaxa subpoblación putativa de células supresor mieloides jan ukaxa células dendríticas plasmacitoides ukanaka uñt’ayaspawa análisis scRNA-seq ukanxa. Ukhampachasa aka panpachaxa yatiyatarakiwa jaqina tumores ovarios ukanakana [45], ukampirusa wali wakisiwa Juk’ampi lurawixa aka subpoblación mieloide ukanaka qhananchañataki.
Ukhamaraki, citometría de flujo ukanakampi lurata lurawixa qhananchaspawa diferencias generales de glucosa ukhamaraki metabolismo oxidativo ukanaka kasta celulanaka taypina, ukampirusa metabolitos precisos ukanakaxa glucosa jan ukaxa yaqha fuentes de carbono ukanakampi luratarakiwa metabolismo mitocondrial TME ukanxa janiwa jichhakamaxa yatxatatäkiti. Asignación de la presencia o ausencia de metabolitos a un subconjunto TIL ukaxa wakisi purificación de la población celular ukatxa tejido excised ukatxa. Ukhamarusa, jiwasana método de enriquecimiento celular ukaxa espectrometría de masas ukampiwa mayachata, ukaxa metabolitos ukanakatxa diferencialmente riquezado ukhamawa células T ukhamaraki poblaciones de células tumorales ukanakana muestras de pacientes ukanakampi chikachasiñataki. Ukhamaraki aka lurawixa ventajas ukaniwa clasificación celular activada por fluorescencia ukatxa, yaqhipa bibliotecas metabolitos ukanakaxa afectatarakispawa estabilidad inherente ukhamaraki/jan ukaxa tasa de rotación rápida (22). Ukhampachasa, jiwasana lurawixa pä uñt’ata metabolitos inmunosupresores, adenosina ukatxa kynurenina ukanakawa, kunatixa muestra tipos ukanaka taypinxa wali mayjt’atawa.
Jiwasana análisis metabonómico tumores ukatxa subtipos TIL ukaxa juk’ampi amuyt’awinaka churaraki metabolitos ukanakana lurawipata TME ovario ukanxa. Nayraqatxa, citometría de flujo ukampixa, yatxatapxaraktwa janiwa mayjt’awixa utjkiti actividad mitocondrial ukanxa tumores ukhamaraki células T CD4 + ukanakampi. Ukampirusa, análisis LC-MS/MS ukaxa uñacht’ayiwa wali mayjt’awinaka aka poblaciones ukanaka taypina metabolitos ukanakana utjatapa, ukaxa uñacht’ayiwa conclusiones ukaxa metabolismo TIL ukatxa actividad metabólica taqpacha ukatxa wali suma qhananchañawa wakisi. Payïri, MNA ukaxa metabolito ukawa, ukaxa jilpachawa mayjt’i CD45-células ukatxa células T ukanakampi ascitis ukanxa, janiwa tumores ukanxa. Ukhamarusa, compartimentación ukatxa tumor ukan utjatapaxa mayja mayjawa metabolismo TIL uksanxa, ukaxa uñacht’ayiwa heterogeneidad ukaxa utjaspawa mä microambiente ukanxa. Kimsïri, expresión de la enzima MNA-productora NNMT ukaxa jilpachaxa CAF ukampikiwa, ukaxa células tumorales ukawa mä juk’a pachana, ukampisa niveles de MNA detectables ukaxa uñjasiwa células T tumorales ukatxa. Aka sobreexpresión de NNMT ukaxa CAF ovario uksanxa mä uñt’atawa cáncer ch’amanchañataki, mä chiqanxa ukaxa ch’amanchatawa metabolismo CAF, invasión tumoral ukatxa metástasis (27). Ukhamaraki, taqpacha nivel de TIL ukaxa moderado ukhamawa, expresión de NNMT ukaxa CAF uksanxa wali jak’akiwa subtipo mesenquimal Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) ukampi, ukaxa mä jan wali pronóstico ukampiwa chikañchasi (27, 46, 47). Tukuyañatakixa, expresión de la enzima AOX1 responsable de la degradación de MNA ukaxa limitada ukhamarakiwa población CAF uksana, ukaxa uñacht’ayiwa células T ukaxa janiwa capacidad metabolizada MNA ukampi utjkiti. Aka yatxatawixa aka amuyunakaru yanapt’iwa, ukampirusa juk’ampi lurañawa wakisi aka yatxatawi chiqapa uñjañataki, ukampirusa, jach’a niveles de MNA ukanakaxa células T ukanxa uñacht’ayaspawa mä microambiente CAF inmunosupresivo ukankatapa.
Uñakipt’ataxa jisk’a nivel de expresión de transportadores de MNA ukhamaraki niveles indetectables de proteínas clave ukanakaxa metabolismo MNA uksanxa, MNA ukan utjatapaxa células T uksanxa janiwa suyt’atakiti. Janiwa NNMT ukhamaraki AOX1 ukaxa yatxatatäkaspati análisis scRNA-seq ukampi ukhamaraki qPCR dirigida ukampi pä cohortes independientes ukanakampi. Aka yatxatawixa uñacht’ayiwa MNA ukaxa janiwa sintetizadakiti células T ukanakampi, jan ukasti absorbida ukhamawa TME muyuntata. Experimentos in vitro ukaxa uñacht’ayiwa células T ukaxa MNA exógena uksa apthapiñatakiwa.
Jiwasana yatxatawinakaxa in vitro ukanxa uñacht’ayiwa MNA exógena ukaxa induce la expresión de TNFα en células T ukatxa ch’amancharaki Sp1 ukaxa promotor TNFα ukaru uñtatawa. Ukhamaraki, TNFα ukaxa antitumoral ukhamaraki antitumoral ukanakampiwa lurataraki, ukampirusa cáncer de ovario uksanxa, TNFα ukaxa cáncer de ovario uksa tuqiruxa ch’amanchaspawa (31-33). Aka neutralización TNFα ukjamaraki cultivo de células tumorales ovarias ukjamaraki eliminación de señal TNFα ukjamaraki modelos de ratas ukjamaraki TNFα-mediada citoquinas inflamatorias ukjamaraki tumor jiltawi jark’aqaraki (32, 35). Ukhamarusa, aka tuqinxa, TME-derivado MNA ukaxa lurasirakispawa mä metabolito proinflamatorio ukhama mä mecanismo dependiente de TNFα tuqi aka lazo autocrino tuqi, ukhamarusa ch’amancharakispawa uñstawi ukhamaraki jilxatawi cáncer de ovario (31). Uka lurawiparjamaxa, bloqueo TNFα ukaxa yatxatatarakiwa mä potencial agente terapéutico ukhama cáncer de ovario ukataki (37, 48, 49). Ukhamaraki, MNA ukaxa citotoxicidad de células CAR-T ukaruxa jan walt’ayiwa células tumorales ovarias ukanakaru, ukaxa juk’ampi uñacht’ayiwa supresión inmune mediada por MNA ukataki. Mayacht’asisa, aka yatxatawinakax mä modelo uñacht’ayi, ukanx tumores ukat células CAF ukanakax MNA ukarux TME extracelular ukar mistuyapxi. Aka (i) TNF-inducida cáncer de ovario jiltawi ch’amanchawimpi ukhamaraki (ii) MNA-inducida actividad citotóxica de células T ukanakampi, akaxa doble efecto tumoral ukaniwa (Figure 5D).
Tukuyañatakixa, mä combinación de enriquecimiento celular rápido, secuenciación de células únicas ukhamaraki perfil metabólico ukanakampi, aka yatxatawixa uñacht’ayiwa jach’a mayjt’awinaka inmunometabolómicas tumores ukhamaraki células ascitis ukanakana HGSC usutanakaru. Aka jach’a uñakipañaxa uñacht’ayiwa mayjt’awinaka glucosa uksa apsuñataki ukhamaraki actividad mitocondrial uksa tuqita células T uksa tuqita, ukatxa uñt’atarakiwa MNA ukjamaraki metabolito regulador inmune autónomo no celular ukhama. Aka yatxatawinakax mä impacto ukaniwa kunjams TME ukax metabolismo de células T jaqin cánceres ukan jan walt’ayi. Ukhamaraki, células T ukatxa células cánceres ukanakana nutrientes ukanakatakixa directa competición ukanakaxa yatiyatarakiwa, metabolitos ukanakaxa reguladores indirectos ukhamxa irnaqapxarakispawa tumor progresión ukanaka ch’amanchañataki ukhamaraki inasa respuestas inmunes endógenas ukanaka chhaqtayañataki. Uka juk’ampi qhanañchawixa aka metabolitos reguladores ukanakana lurawipaxa lurawipaxa jist’arasispawa estrategias alternativas ukanaka ch’amanchañataki respuesta inmune antitumoral.
Usutanakan especímenes ukat datos clínicos ukanakax repositorio de tejido tumoral de cáncer BC ukan apsutawa, ukax Red Canadiense de Repositorios de Tejidos ukan certificado ukanïnwa. Uka protocolo ukarjamaxa, Comité de Ética de Investigación del Cáncer BC ukat Universidad de Columbia Británica (H07-00463) ukanakan iyawsataparjamaxa, taqi usutanakan especímenes ukat datos clínicos ukanakax consentimiento informado escrito ukar apsutawa jan ukax formalmente consentimiento ukarux jaytawayi. Uka muestras ukaxa BioBank certificado (BRC-00290) ukanwa imatäxi. Usutanakan suma uñacht’awinakapax Tablas S1 ukat S5 ukan uñacht’ayatawa. Criopreservación ukatakixa, mä bisturí ukampiwa usuta jaqina tumor muestrapa mecánicamente descompone ukatxa filtro de 100 micras ukampiwa ch’allt’asi, ukhamata mä sapa suspensión celular apsuñataki. Usutaruxa ascitis ukxa centrifugada 1500 rpm 10 minutos 4 °C ukjamaru pellet sata celulanakaru ukhamaraki sobrenadante uksa apsuñataki. Aka células apsutanakaxa tumor ukhamaraki ascitis ukjamaraki criopreservadas ukjamaraki 50% de suero humano AB inactivado por calor (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ukhamaraki 10% sulfóxido de dimetilo. Aka suspensiones de células únicas conservadas ukaxa descongelados ukhamaraki metabolómica ukhamaraki determinación de metabolitos ukataki apnaqatarakiwa aka amparampi lurata.
Aka medio completo ukaxa 0,22 μm filtrado 50:50 ukjamaraki RPMI 1640: AimV ukjamaraki. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki 10% ukja suero humano AB inactivado por calor (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicilina Estreptomicina (PenStrep) ukjamaraki (Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki 50 μMB-mercaptoetanol ukjamaraki. AimV (Invitrogen) ukjamaraki 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki. Aka tampón de tinción citometro de flujo ukaxa 0,22μm ukjamaraki salina tamponada fosfato filtrada (PBS; Invitrógeno) ukjamaraki 3% ukja suero humano AB inactivado por calor (Sigma) ukjamaraki. Aka tampón de enriquecimiento celular ukaxa luratarakiwa 0,22μm PBS filtrado ukjamaraki suplementado ukhamaraki 0,5% suero humano AB inactivado por calor (Sigma-Aldrich).
Aka medio completo 37 °C uksanxa, celulanakaxa 10 nM MT DR ukhamaraki 100 μM 2-NBDG 30 minutos ukjamawa tintayataraki. Ukxarusti, celulanakaxa tinte de viabilidad eF506 ukampiwa 4 °C 15 minutos ukjamaru tintayataraki. Aka celulanakaxa FC Block (eBioscience) ukhamaraki Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ukanakampi mayampi suspendiña, diluida en tampón de tinción citometro de flujo (fabricante ukana kamachinakaparjama), ukatxa 10 minutos temperatura ambiente uksana incubada. Aka celulanakaxa mä conjunto de anticuerpos (Tabla S2) ukampiwa tampón de tinción de citometría de flujo ukanxa 4 °C ukjamaru 20 minutos ukjamaru tintayataraki. Aka celulanakaxa tampón de tinción citometría de flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) ukjamaraki janïra análisis ukampi luratarakiwa. SpectroFlo ukatxa FlowJo V10 ukampi celula jakthapiwi yatiyawi uñakipañataki, ukatxa GraphPad Prism 8 ukampi yatxataña lurañataki. Aka intensidad mediana de fluorescencia (MFI) 2-NBDG ukatxa MT DR ukaxa log-normalizado ukhamawa, ukatxa mä prueba t pareada ukampi luratarakiwa análisis estadístico ukatakixa ukhamata cuentas de pacientes correspondientes. Taqi poblaciones ukanakax 40 eventos ukanakat juk’ampikiw análisis ukanx apsuña; mä IMF valor 1 ukar mantañapawa kuna jan wali valores ukanakatakis janïr análisis estadístico ukat datos visualización lurañ tukuykasaxa.
Ukhamarusa, aka pata tuqina panel de procesos ukanxa estrategia de gating manual ukampi yapxatañatakixa, taqpacha anotación ukampi luratarakiwa quqa restricción de forma (FAUST) (21) ukampiwa, ukhamata automáticamente celulas asignar a la población ukatxa jiwata celulas FlowJo uksana chhaqtayata. Jiwasaxa manualmente apnaqapxtanwa uka mistuwixa mayachañataki poblaciones ukanakaxa jani wali asignadas ukhama (PD1+ ukampi PD1-células tumorales ukanakampi mayachata) ukhamaraki poblaciones retenidas ukanakampi. Sapa muestra ukaxa mä promedio 2% ukja celulas ukjawa, taqpachaxa 11 poblaciones ukjawa.
Aka centrifugación de densidad de gradiente de ficoll ukjamaraki PBMC ukjamaraki leucocitos ukjamaraki leucocitos ukjamaraki (STEMCELL Technologies) ukjamaraki. Aka células CD8 + T ukaxa PBMC uksatxa apsutarakiwa CD8 MicroBeads (Miltenyi) ukjamaraki medio completo uksana TransAct (Miltenyi) ukampiwa 2 semanas ukjamaraki fabricante ukana kamachinakaparjama. Aka celulanakaxa 5 urunakawa sayt’ayataraki medio completo ukanxa IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ukanxa, ukxaruxa mayampiwa estimulada TransAct ukampiwa. 7 uruxa, lurayirina kamachiparjamaxa, jaqina CD45 MicroBeads (Miltenyi) ukanakampiwa celulanakaru qamiriptayañatakixa kimsa muyuntata mayachata. Aka celulanakaxa alicuotadas ukhamaraki análisis de citometría de flujo (kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata), ukatxa mä millón celulanakaxa kimsa kutiwa alicuotadas ukhamaraki análisis LC-MS/MS ukataki. Aka muestras ukaxa LC-MS/MS ukampiwa lurataraki kunjamatixa akhamawa qhananchata. Jiwasaxa metabolito chhaqhata valores ukanakaxa 1.000 iones ukanakampiwa jakhthapita. Sapa muestra ukaxa normalizada ukhamawa total número de iones (TIC), logarítmicamente convertido ukhamaraki automáticamente normalizada MetaboAnalystR uksana janïra análisis ukampi.
Sapa usuta jaqina suspensión de células únicas ukaxa descongelada ukhamaraki filtrada filtro 40 μm ukjamaraki medio completo ukarjama (kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata). Aka protocolo fabricante ukarjamaxa, kimsa ronda consecutivas de selección positiva ukjamaraki separación magnética de perlas ukanakampi MicroBeads (Miltenyi) ukampiwa lurataraki, ukhamata muestras ukanaka qamiriptayañataki células CD8+, CD4+ ukhamaraki CD45- (hielo uksana). Mä juk’a arumpixa, celulanakaxa resuspendidas ukhamawa tampón de enriquecimiento celular (kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata) ukatxa jakthapitawa. Aka celulanakaxa jaqina CD8 perlas, jaqi CD4 perlas jan ukaxa jaqi CD45 perlas (Miltenyi) ukanakampiwa incubadas 4 °C 15 minutos ukjamaru, ukxaruxa tampón de enriquecimiento celular ukampiwa jaqukipataraki. Muestra ukaxa columna LS (Miltenyi) uksa tuqita pasatarakiwa, ukatxa fracciones positivas ukatxa negativas uksa apthapitawa. Ukhamarusa, aka pacha jisk’achañataki ukhamaraki jach’a celulanakaru kutt’ayañataki, ukatxa CD8-fracción ukaxa payïri muyunta CD4+ riqueza ukataki apnaqatarakiwa, ukatxa CD4-fracción ukaxa qhipa CD45-enriquecimiento ukatakixa apnaqatarakiwa. Uka solución ukaxa hielo patxaru uchañawa taqi t’aqa t’aqa pachana.
Aka muestras wakicht’añatakixa análisis de metabolitos ukatakixa, celulanakaxa mä kutiwa jariqataraki solución de sal hielo frío ukampiwa, ukxaruxa 1 ml de metanol 80% ukjamaraki sapa muestra ukarux apxatarakiwa, ukxaruxa vortex ukjamaraki snap congelado nitrógeno líquido ukjamaraki. Aka muestras ukjamaraki kimsa ciclos de congelación-descongelación ukjamaraki centrifugada 14.000 rpm 15 minutos a 4 °C. Aka sobrenadante ukaxa metabolitos ukanakampiwa wañt’ayataraki. Aka metabolitos ukxa mayampi ch’amanchatarakiwa 50 μl de ácido fórmico 0,03% ukjamaraki vortex ukjamaraki misturaki, ukxaruxa centrifugada ukjamaraki residuos uksa apsuñataki.
Metabolitos uksa apsuña kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata. Uka sobrenadante ukaxa mä botella de cromatografía líquida de alto rendimiento ukarjamawa metabolómica yatxatañataki. Mä protocolo de tratamiento aleatorio ukampiwa sapa muestra ukaxa mä kipka jakhuwi celulanakampi qullañatakixa, ukhamata jani efectos de lote ukanaka utjañapataki. Jiwasaxa lurapxtanwa mä evaluación cualitativa metabolitos globales ukanakatxa nayraqata uñt’ayata Espectrómetro de Masas Triple Cuadrúpolos AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Análisis cromatográfico ukhamaraki integración de área pico ukaxa luratarakiwa software MultiQuant versión 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) ukampiwa.
Mä conteo de iones 1000 ukjamaraki metabolito faltante ukjamaraki TIC ukjamaraki sapa muestra ukjamaraki área pico normalizada sapa metabolito detectado ukjamaraki chiqañchañataki mayjt’awinaka uñt’ayata análisis instrumental ukjamaraki procesamiento de muestras ukjamaraki. TIC normalizado ukxaruxa, MetaboAnalystR(51) (parámetro predeterminado) ukaxa conversión logarítmica ukatxa escalado automático de línea norma ukataki apnaqatarakiwa. PCA ukampi vegano R paquete ukampi luratarakiwa análisis exploratorio metabólomo ukan mayjt’awinakapata tipos de muestra ukanaka taypina, ukatxa análisis de redundancia parcial ukampi usutanakaru uñakipañataki. Método Ward ukampixa dendrograma de mapa de calor uka lurañatakixa, muestras ukanaka taypina distancia euclídea ukanaka agrupación lurañataki. Jiwasaxa limma (52) ukjamaraki abundancia estandarizada de metabolitos ukjamaraki metabolitos diferencialmente abundantes ukanaka uñt’añataki taqpacha tipo celular ukhamaraki microambiente uksana. Qhanañchawi jani ch’amt’ayañatakixa, parámetro medio de grupo ukampi modelo uñacht’ayañatakixa apnaqatarakiwa, ukatxa microambiente uksanxa celulas tipos ukanakaxa sapa qutuchata uñakipatawa (n = 6 qutu); significancia yant’awitakixa, sapa metabolito ukatakixa kimsa kuti tupuña lurapxarakta Jani k’ari replicación utjañapatakixa, usuta jaqixa mä jark’awijamawa diseño limma uksanxa uñakipata. Kunayman usutanakan metabolitos ukanakan mayjt’awip uñakipañatakix, modelo limma ukanx usutanakarux mä fijo ukham chiqanchapxta. Jiwasaxa yatiyaraktanwa aka contraste preespecificado ukaxa wali wakiskiriwa aka tipo celular ukhamaraki microambiente Padj <0,05 (corrección Benjamini-Hochberg).
Uka vigor enriquecimiento ukxaruxa Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilidad) ukampiwa lurataraki, secuenciación de transcriptoma de células únicas ukaxa luratarakiwa taqpacha ascitas congeladas vivas ukhamaraki muestras tumorales ukanakampi mä protocolo de expresión génica 10x 5′génica ukampiwa. Pä casos ukanakax tumores ukat ascitis ukanakamp chikancht’ataw uñakipata, ukampirus mä muestra tumoral ukan jisk’a viabilidad ukax jark’iwa. Walja ajlliwi usutanakaru puriñapatakixa, sapa usuta muestras ukanakaxa carriles del controlador de cromo 10x ukanxa mayachapxaraktwa, ukatxa ascitis ukatxa tumor ukanaka sapa mayniru uñakipapxarakta. Uka secuenciación ukxaruxa [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp pareada ukjamaraki (PE), genoma Quebec; mä promedio 73.488 ukhamaraki 41.378 lecturas por célula tumor y ascitis respectivamente]], ukaxa CellSNP ukatxa Vireo (53) (based on CellSNP as The common human SNP (VCF) provided by GRCh38 is asigned a donor identity. Jiwasaxa SNPRelate ukampiwa inferir la identidad más cercana (IBS) del estado genotipo del paciente (IBS), excluyendo células no asignadas y células identificadas como dúplex y emparejamiento de donantes entre muestras de ascitis y tumores (54) Aka lurawi tuqita, kimsa casos ukanakaxa walja representación celular ukanakampiwa katxaruta, análisis aguas abajo ukataki (2792 ukhamaraki 4183 células tumorales ukatxa ascitas, respectivamente) análisis ukatakixa igraph’s (57) Louvain clustering de red vecino compartida (SNN) basada en distancia Jaccard a células clústeres por expresión Uka clústeres ukaxa manualmente anotado ukhamawa tipos de células putativas basadas en expresión génica T-SNE definida por la expresión de CD8A y GZMA, excluyendo subclústeres con baja expresión proteica ribosómica Jiwasaxa acceso a datos publicados de Izar et al (16), ukhamaraki jupanakana t-SNE incrustación, ukaxa controlar la superposición de expresión entre marcadores de células inmunes ukatxa expresión NNMT.
PBMC ukaxa apsutarakiwa productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) ukanakatxa centrifugación de densidad de gradiente Ficoll ukampiwa. CD3 + celulas ukaxa PBMC uksatxa apsutarakiwa CD3 perlas (Miltenyi) ukampiwa. Aka MNA utjatapata jani ukaxa jani utjatapata, células CD3+ ukaxa activadas ukhamaraki CD3 (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) ukhamaraki IL-2 (300 U/ml; Proleucina) ukanakampi. Qhipa uru jach’anchayañatakixa, viabilidad (Tinte de Viabilidad Fijable eFluor450, eBioscience) ukhamaraki proliferación (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ukanakaxa citometría de flujo ukampiwa uñakipata. Aka efector lurawixa uñakipatawa células PMA (20 ng/ml) ukhamaraki ionomicina (1μg/ml) ukanakampi GolgiStop ukampiwa 4 horas ukjama, ukhamaraki uñjaña CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) ukhamaraki TNFα-fluoresceína isotiocianato (FITC) (MAb11, BD). Aka células qPCR ukhamaraki ChIP ukanakaxa PMA (20 ng/ml) ukhamaraki ionomicina (1μg/ml) ukanakampiwa 4 horas ukjamaru ch’amanchataraki. Aka sobrenadante ELISA ukxa apthapitawa nayraqata ukhamaraki qhiparu estimulación PMA (20 ng/ml) ukhamaraki ionomicina (1 μg/ml) ukanakampi 4 horas.
Uka lurayirina protocolo ukarjamawa ARN uksa apsuñatakixa RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ukampiwa lurataraki. QIAshredder (QIAGEN) ukampiwa muestra homogeneización lurañataki. Ukaxa kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific) ukampiwa ADN complementario (ADNc) sintetizañatakixa. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ukampixa expresión génica (protocolo fabricante ukarjama) aka sondas ukanakampiwa jakhthapita: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), . Hs02786624_g1 [gliseraldehído-3-fosfato off Hidrógeno (GAPDH)] ukhamaraki Hs01010726_m1 (SLC22A2). Aka muestras ukaxa luratarakiwa sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ukanxa MicroAmp rápido óptico 96 pozos placa de reacción (Applied Biosystems) ukanxa película óptica MicroAmp ukampiwa lurataraki. Kawkiri Ct valores ukaxa 35 ukjata jila uñakipatawa, ukaxa umbral de detección uksatxa jilpachawa uñjasiraki, ukatxa janiwa uñjañjamakiti.
ChIP luraña kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata (58). Mä juk’a arumpixa, celulanakaxa formaldehído (concentración final 1,42%) ukampiwa lurataraki, ukatxa incubadas a temperatura ambiente 10 minutos. Ukhamaraki, tampón de hinchazón suplementado (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl y 0,1% NP-40) ukjamaraki hielo ukjamaraki 10 minutos ukjamaraki resuspendir tampón inmunoprecipitación ukjamaraki kunjamatixa qhananchaski ukhama (58 ). Ukatxa muestra ukaxa sonicada ukhamawa aka ciclos ukanakampi: 10 ciclos (20 pulsos de 1 segundos) ukhamaraki mä tiempo estático 40 segundos. Incubar anticuerpos de inmunoglobulina G (Tecnología de Señalización Celular; 1μl), histona H3 (Tecnología de Señalización Celular; 3μl), NFAT (Invitrógeno; 3μl) ukhamaraki SP1 (Tecnología de Señalización Celular; 3μl) ukanakampi aka muestra ukampi 4°CC ukjamaru mä aruma ch’allt’aña. Aka proteína A (Thermo Fisher Scientific) ukjamaraki muestra ukjamaraki 4°C ukjamaru llamp’u ch’allt’añampi 1 hora, ukxaruxa perlas quelex (Bio-Rad) ukanakampiwa ADN qamiriptayaña, ukatxa proteinasa K (Thermo Fisher) ukampiwa digestión proteica ukjamaraki. TNFα promotor ukaxa PCR tuqiwa uñakipata: nayraqataru, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ukatsti, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (producto 207 pb). Uka uñacht’awinakax Image Lab (Bio-Rad) ukan luratawa, ukatx software ImageJ ukampiw jakhthapita.
Aka sobrenadante de cultivo celular ukaxa apthapitawa kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata. Aka determinación ukaxa luratarakiwa lurawiparjama aka kit de ELISA TNFα humano (Invitrogen), kit de ELISA de IL-2 humano (Invitrogen) ukhamaraki kit de ELISA IFN-γ humano (Abcam). Aka protocolo fabricante ukarjamaxa, aka sobrenadante ukaxa diluida 1:100 ukjamawa TNFα ukhamaraki IL-2 ukanaka uñt’añataki, ukatxa 1:3 ukjamawa IFN-γ uñt’añataki. Aka EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ukampixa absorbancia 450 nm ukjamawa.
PBMC ukaxa apsutarakiwa productos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) ukanakatxa centrifugación de densidad de gradiente Ficoll ukampiwa. CD3 + celulas ukaxa PBMC uksatxa apsutarakiwa CD3 perlas (Miltenyi) ukampiwa. MNA utjatapa jan ukaxa jani utjatapatxa, células CD3+ ukaxa activadas ukhamaraki CD3 (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) ukhamaraki IL-2 (300 U/ml; Proleucina) ukanakampi 3 urunaka. 3 urunakatxa, celulanakaxa apthapitawa ukatxa jariqatarakiwa 0,9% salina ukampiwa, ukatxa pellet ukaxa snap congelado ukhamawa. Aka celula jakthapiwixa luratarakiwa citometría de flujo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) ukampiwa 123count eBeads ukampiwa lurataraki.
Metabolitos uksa apsuña kunjamatixa nayraqata uñacht’ayata. Aka waña extracto ukaxa mayampi luratarakiwa mä concentración 4000 equivalentes celulares/μl. Aka muestra ukjamaraki cromatografía de fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ukhamaraki columna CORTECS T3 (2,1×150 mm, tamaño de partícula 1,6-μm, tamaño de poros 120-Å; #186008500, Waters) ukanakampiwa uñakipata. Espectrómetro de masas polares (6470, Agilent), ukanxa ionización electrospray ukaxa lurasirakiwa modo positivo ukanxa. Fase móvil A ukaxa 0,1% ácido fórmico (H2O uksana), fase móvil B ukaxa 90% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico. Aka gradiente LC ukjamaraki 0 ​​a 2 minutos ukjamaraki 100% A ukjamaraki 2 a 7,1 minutos ukjamaraki 99% B ukjamaraki 7,1 ukjamaraki 8 minutos ukjamaraki 99% B. Ukxarusti mayampi equilibrar la columna fase móvil A ukjamaraki caudal 0,6 ml/min 3 minutos ukjamaraki. . Aka caudal ukaxa 0,4ml/min ukjamawa, ukatxa cámara de columna ukaxa 50°C ukjamawa. Aka MNA ukaxa q’uma estándar químico (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadá) ukampiwa utt’ayataraki, ukhamata utt’ayañataki pacha de retención (RT) ukhamaraki transformación (RT = 0,882 minutos, transformación 1 = 137→94,1, transformación 2 = 137→92 , Conversión 3 = 137→78). Kunawsatixa kimsa mayjt awinakaxa chiqapa retención pachana utjki ukjaxa, transición 1 ukaxa cuantificación ukataki apnaqatarakiwa, ukhamata especificidad uñakipañataki. Aka curva estándar de MNA (Toronto Research Chemical Company) ukjamaraki suxta diluciones serie ukjamaraki solución de stock (1 mg/ml) ukjamaraki normas 0,1, 1,0, 10 ukhamaraki 100 ng/ml ukjamaraki 1,0 ukhamaraki 10μg/ml ukjamaraki líquido ukjamaraki. Aka límite de detección ukaxa 1 ng/ml ukjamawa, ukatxa respuesta lineal ukaxa 10 ng/ml ukjamaraki 10μg/ml ukjamawa. Sapa inyección pä microlitros de muestra ukhamaraki estándar ukaxa apnaqatarakiwa análisis LC/MS ukataki, ukatxa mä muestra de control de calidad mixto sapa llätunka inyecciones ukanakampiwa lurataraki, ukhamata plataforma de análisis ukanxa estabilidad ukaxa utjañapataki. Taqi MNA-tratadas células muestras ukanakana MNA respuestas ukanakaxa ensayo lineal ukankiwa. Uka yatxatawi thakhixa software de análisis cuantitativo MassHunter (v9.0, Agilent) ukampiwa lurataraki.
Payïri generación αFR-CAR lurawixa Song et al. (59) ukat juk’ampinaka. Mä juk’a arumpixa, aka lurawixa aka contenido ukaniwa: secuencia líder CD8a, fragmento variable de una sola cadena específica humana αFR, bisagra CD8a ukatxa región transmembrana, dominio intracelular CD27 ukatxa dominio intracelular CD3z. Aka secuencia CAR phuqhata sintetizada GenScript tuqi, ukxaruxa clonada vector de expresión lentiviral de segunda generación ascendente del cassette de expresión GFP ukaxa apnaqatarakiwa eficiencia de transducción uñakipañataki.
Lentivirus ukaxa luratarakiwa transfección de células HEK293T [Colección Americana de Cultivo de Tipo (ATCC); jiltatarakiwa aka medio Eagle modificado de Dulbecco ukjamaraki 10% suero fetal bovino (FBS) ukhamaraki 1% PenStrep, ukatxa vector CAR-GFP ukampi apnaqatarakiwa ukatxa The packaging plasmids (psPAX2 y pMD2.G, Addgene) ukaxa amina lipofección (Sigma-Aldrich) ukampiwa lurataraki. Aka sobrenadante virus ukampi apthapitawa 48 ukhamaraki 72 horas ukja transfección ukxaruxa, filtrada ukhamaraki concentrada ultracentrifugación tuqi. Aka sobrenadante viral concentrado ukaxa -80 °C uksanwa imañawa transducción uksakama.
PBMC ukaxa k’umara donantes leucocitos uksa tuqita jaljatawa (STEMCELL Technologies) ukjamaraki centrifugación de densidad de gradiente Ficoll tuqi. Aka microperlas CD8 selección positiva (Miltenyi) ukanakampiwa lurataraki, ukhamata células CD8+ ukanaka PBMC uksatxa yaqhawjaru apsuñataki. Células T ukaxa TransAct (Miltenyi) ukampi ukhamaraki medio TexMACS ukampi [Miltenyi; ukjamaraki 3% ukja jaqina suero inactivado por calor, 1% PenStrep ukhamaraki IL-2 (300 U/ml)]. Pä tunka pusini horanaka estimulación ukxaruxa, células T ukaxa transducidas ukhamaraki lentivirus (10 μl sobrenadante concentrado de virus por 106 células). 1 a 3 urunakata transducción ukxaru Cytek Aurora (en FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), uñakipatarakiw expresión GFP celulanakaru uñacht’ayañataki mä eficiencia de transducción 30% ukjama.
Aka células CAR-T ukjamaraki 24 horas ukjamaraki Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementada con 1% PenStrep) ukjamaraki aka condiciones ukanakampi: janïra tratada, tratada 250 μM adenosina jan ukaxa 10 mM MNA. Nayraqata tratamiento ukxaruxa, células CAR-T ukaxa PBS ukampiwa jariqataraki ukatxa 20.000 células SK-OV-3 ukampiwa mayachataraki [ATCC; aka medio McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ukjamaraki 10% FBS ukjamaraki 1% PenStrep ukjamaraki 10 ukjamaraki: Aka efector a meta ratio 1 ukjamaraki amplificada kimsa kutiwa medio Inmunocult suplementado ukjamaraki. Aka SK-OV-3 ukjamaraki SK-OV-3 ukjamaraki lisis digitalis saponina (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) ukjamaraki control negativo ukhamaraki positivo ukjamaraki. Aka 24 horas ukjamaraki co-cultivo ukjamaraki, aka sobrenadante ukjamaraki lactato deshidrogenasa (LDH) ukjamaraki fabricante ukana kamachinakaparjama (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) ukjamaraki. Aka sobrenadante LDH ukaxa diluida 1:50 ukjamawa tampón LDH ukjamaraki. Sapa patakata jiwayawixa aka fórmula ukampiwa tuputaraki: sapa patakata jiwayata = sapa patakata corrección / tasa máxima de muerte x 100%, kawkhantixa sapa patakata corrección = células co-cultivo-T ukaki, ukhamaraki tasa máxima jiwayaña = control positivo-negativo.
Kunjamatixa qillqatanxa jan ukaxa materiales ukatxa métodos ukanakana qhananchata, GraphPad Prism 8, Microsoft Excel jan ukaxa R v3.6.0 ukampi análisis estadístico ukampi luratarakiwa. Walja muestras ukanakax pachpa usutat apthapitax (kunjamakitix ascitis ukat tumor), mä prueba t pareada ukampiw apnaqasi jan ukax usutarux mä efecto aleatorio ukhamaw modelo lineal jan ukax generalizado ukanx kunjamatix wakiski ukhamarjama. Metabolómica uñakipañatakixa, importancia yant’awixa kimsa kutiwa lurataraki.
Aka qillqatan materiales suplementarios ukanakatakix http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ukar mantasma
Akax mä qillqat jist’arat uñt’ayawiwa, ukax Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ukan kamachinakaparjamaw jaljasi, ukax kuna medios ukan apnaqañapataki, jaljañapataki ukhamarak uñstayañapatakiw jayti, kunapachatix qhipa apnaqañax jan comercial ganancia ukat premisa ukax nayrïr lurawix chiqaw sañ muni. Yaqha.
Qhanacht’awi: Correo electrónico ukar uñt’ayañakiw mayipxsma, ukhamat khititix página ukar iwxt’kta ukax yatiñapataki, jupanakax correo electrónico ukar uñjañ munapxta ukat janiw spam ukhamäkiti. Jiwasax janiw kuna correo electrónico ukanakas katjañäniti.
Aka jiskt’awix mä visitante ukhamätati janicha uk yant’añatakiw apnaqasi ukat automático spam ukar jan uñt’ayañatakiw apnaqasi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacarías (Lauren G. Zacarias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell) ukat yaqhanakampi G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T. ukat yaqhanakampi.
MNA ukax células T ukan inmune supresión ukarux yanapt’iwa ukatx mä potencial objetivo de inmunoterapia jaqin cáncer usut qullañatakix uñacht’ayi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacarías (Lauren G. Zacarias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell) ukat yaqhanakampi G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T. ukat yaqhanakampi.
MNA ukax células T ukan inmune supresión ukarux yanapt’iwa ukatx mä potencial objetivo de inmunoterapia jaqin cáncer usut qullañatakix uñacht’ayi.
©2021 Asociación Americana para el Adelanto de Ciencia uka tuqita. taqi derechos ukanakaxa jark’atawa. AAAS ukax HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ukat COUNTER ukanakan yanapiripawa. CienciaAvances ukax ISSN 2375-2548 ukaruw uñt’ayasi.